他克莫斯对树突状细胞分化、成熟和功能的影响论文.docVIP

　　他克莫斯对树突状细胞分化、成熟和功能的影响论文 郑凯 谭建明 吴卫真 杨顺良 徐廷昭 【摘要】 目的：探讨他克莫斯（tacrolimus, FK506）对大鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)分化、成熟和免疫学活性的影响. 方法：收集大鼠骨髓源性DCs，加入不同浓度的FK506进行培养，采用流式细胞术行DCs表型分析，ELISA法检测培养上清中IL12 的水平并行体外混合淋巴细胞反应（MLR），观察DCs对同种T细胞的刺激能力. 构建大鼠肾移植模型，于移植前7 d输注FK506处理的DCs，观察移植肾存活时间. 采用ELISA法检测MLR培养上清和移植大鼠血清中TH1/TH2细胞因子IFNγ，IL2.freelus (FK506) on the differentiation, maturation and function of rat bone marrous at concentrations of 5-20 μg/L to the DCs culture and checked the expressions of activation markers (Iad, CD80 and CD86) by floetry, the release of cytokines IL12 by ELISA and the stimulatory capacity of the resulted DCs by mixed lymphocyte reaction (MLR). Thirty CSF)与外源性脂多糖(LPS)（Sigma公司）；RPMI 1640培养基及胎牛血清（Gibco公司）；PE标记的小鼠抗大鼠Iad，CD80，CD86 mAb（eBioscience公司）；IL12，IL4，IL10，IL2， IFNγ的ELISA试剂盒（Bender公司）；3HTdR（Amersham Life Science公司）. EpicXL型流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司). 1.2方法 1.2.1骨髓来源DCs的提取与鉴定参照文献［2］的方法，取SD大鼠（供者）股骨，冲洗出骨髓细胞，以1∶10的体积比加入37℃预温的TrisNH4Cl去除红细胞；加GNK缓冲液终止反应，离心洗涤2次；用RPMI 1640调细胞密度为1×109/L，37℃, 50 mL/L CO2条件下培养2 h；轻轻洗去非粘附细胞；在贴壁细胞中加入含10 μg/L rrIL4和10 μg/L rrGMCSF的RPMI 1640完全培养基，37℃, 50 mL/L CO2条件下培养6～7 d，收集生长状态良好的DCs备用. 1.2.2DCs表型与分泌IL12水平分析将DCs分成4组，每组设3复孔：① 对照组(DCs组)；② FK506处理组(FK506DCs组)：培养液中加入不同浓度FK506（5, 10, 20 μg/L）；③ 脂多糖刺激组(LPSDCs组)：在培养结束前18 h加入100 μg/L LPS；④ FK506处理+脂多糖刺激组(FK506LPSDCs组). 在37℃, 50 mL/L CO2条件下培养7 d，收集培养上清液，ELISA方法检测IL12水平（按试剂盒说明书进行）. 收获细胞（2×109/L）；分别加入PE标记的抗Iad, 抗CD80或抗CD86 mAb(终浓度5 mg/L)，4℃作用45 min；流式细胞仪分析，以中位荧光强度（MFI）作为检测指标. 1.2.3体外混合淋巴细胞反应(MLR)分析取I 1640培养基培养72 h；于培养结束前18 h每孔加入3HTdR 3.7×104 Bq；β计数仪测量待测细胞的3HTdR掺入值(cpm). 1.2.4大鼠肾移植模型的建立与分组以SD大鼠为供体、LR中，加入3HTdR前收集培养上清；动物实验中，移植7 d后抽取受鼠尾静脉血并分离血清，ELISA试剂盒说明书分别检测IFNγ, IL2, IL4和IL10 水平. 统计学处理： 应用SPSS 10.0软件包进行数据处理， 两组间比较采用随机分组t检验方法， 多组间比较采用单因素方差分析方法， 以P 0.05为判定标准. 2结果 2.1DCs表型分析FK506DCs组Iad,CD80和CD86的表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P 0.05). LPS刺激后,Iad,CD80和CD86的表达显著增加，与未处理组比较差异有统计学意义(P 0.05)，但FK506对其无明显影响，LPS DCs组与FK506 LPS DCs组比较差异无统计学意义(P 0.05,表1).表1他克莫斯(FK506)和外源性脂多糖(LPS)对DC表面分子表