以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较论文.docVIP

　　以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较论文 刘永刚，李芳菲，陈地龙，王莎莉，王亚平 【关键词】 STO细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类 parison betbryonic germ cells 【Abstract】 AIM: To pare the influence on the groan embryonic germ (EG) cells by SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain resistant (STO) cells and human embryonic lung fibroblasts（hELF）respectively as feeder layers and the changes of the tselves processed itomycin C. METHODS: EM培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）购自GIBICO公司； 无钙镁磷酸缓冲液 (Dulbeccos phosphate buffered saline, DPBS)、非必需氨基酸、二甲基亚砜、优质胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶、β巯基乙醇、毛喉素（Forskolin）购自Sigma公司；丝裂霉素C 购自Kyoan rebinant basic fibroblast groan rebinant leukemia inhibitory factor, hrLIF)购自CHEMICON公司；抗阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)mAb和抗阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)mAb由美国芝加哥大学Dr. Bruce Lahn提供；UltrasenstinveTM SP试剂盒购自迈新公司； DAB显色试剂盒购自中山公司；6～11 o胚胎用于制备hELF；STO细胞由本室保存. 1.2方法 1.2.1hELF分离、培养及铺板无菌条件下取3～4 mo人工流产胚胎肺组织，按照薛庆善等的方法分离获取hELF，常规方法培养传代，经反复传代获得纯化的hELF. 取对数生长期hELF，用终浓度为12.5 μg/mL丝裂霉素C处理2.5～3 h；DPBS洗3次； 2.5 g/L胰酶消化2 min；DPBS洗3次；以细胞浓度为2×105/mL种植在1 g/L明胶处理后的24孔培养板中，每孔1 mL；置37℃，95%湿度和50 mL/L CO2恒温细胞培养箱中培养，4 h后吸去培养液和尚未贴壁的细胞，换入等量培养液，置培养箱中备用，1 L丝裂霉素C按上述方法处理备用. 1.2.3人胚胎生殖嵴细胞的分离和培养无菌条件下取得的6～11 L的胶原酶0.5 mL, 37℃下消化45 min；灭菌加样枪反复吹吸，将生殖嵴离散为小细胞团；1 g/L的胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA溶液，37℃下消化5 min；加入等体积含100 mL/L胎牛血清的培养液终止反应；加入200 U的DnaseⅠ作用10 min；轻柔吹打使细胞分离，胚胎干细胞培养液重悬后以1×105, 1×10, 1×103/mL三种浓度种植于STO细胞和hELF细胞饲养层，胚胎干细胞培养液包含800 mL/L高糖DMEM,.freelL/L胎牛血清,2 mmol/L L谷胺酰氨,0.1 mmol/L非必需氨基酸,0.1 mmol/L 2巯基乙醇,10 μmol/L Forskolin, 2 μg/mL hrbFGF, LIF 10×105 IU/L, 10×104 IU/L青霉素和10×104 IU/L链霉素. 置50 mL/L CO2, 95%湿度,37℃恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基. 1.2.4形态学观察用胚胎干细胞生长培养液培养经丝裂霉素C处理后的STO细胞饲养层和hELF饲养层14 d，在倒置相差显微镜下观察两种饲养层细胞的形态变化. 倒置相差显微镜下观察在STO细胞饲养层和hELF饲养层上人EG细胞集落形态. 1.2.5在STO细胞和hELF饲养层上EG细胞集落形成率用胚胎干细胞生长培养液将消化后的人胚胎生殖嵴细胞稀释成1×105, 1×104, 1×103/mL的细胞悬液，分别种植于STO细胞和hELF饲养层上，每种细胞浓度种植4个复孔. 置于37℃, 50 mL/L CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基. 计算集落形成率，即4个复孔形成集落总数与种植细胞总数之比. 1.2.6免疫细胞化学检测取两种饲养层细胞上形成的集落，40 g/L多聚甲醛固定15~20 min；经PBS洗3次；按免疫组化SABC法检测细胞表面抗原SSEA1和SSEA4（一抗工作浓度为1∶50）. 设不加一抗组为阴性对照组. 统计学处理