体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验研究论文.docVIP

　　体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验研究论文 【摘要】 探讨软骨组织工程方法修复骨软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。［方法］体外诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞定向分化，分别与PLGA支架复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬关节骨软骨缺损深层置入MSC－支架复合体，浅层置入诱导培养后的MSC－支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。［结果］16周实验组缺损区完全由透明软骨修复，与周围正常软骨完全融合.freelplanted cellscaffold posites, cultured MSCs as seed cells and PLGA as scaffolds,and to acquire desirable seed cells and scaffold materials.［Method］BMSCs planted into osteochondral defects on canine models by using techniques of mosaicplasty, induced BMSCPLGA scaffold posites in the top of the defect and BMSCPLGA scaffold posites in the bottom of the defect, osteochondral posites ental group itransparent smooth argins betost of the repair tissue aintained their thickness to the full depth of the original defects. The subchondral bone odeled. The tidemark ed aterials for repairing cartilage defects. Key esenchymal stem cells(MSCs); mosaicplasty; osteochondral posites; osteochondral defect 关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病，以往临床使用的治疗方法均难以达到理想的要求。组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了前所未有的机遇。本实验研究的目的是采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（MSCs）为种子细胞，经软骨细胞诱导生长因子的诱导培养后，与聚羟基乙酸（poly glycolic acid， PLA）－聚乳酸（poly lactic acid， PGA）共聚物(PLGA)支架材料复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬膝关节骨软骨缺损深层置入MSC－支架复合体，浅层置入诱导培养后的软骨细胞－支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。期望能够找到软骨组织工程理想的种子细胞和支架材料。 1 材料和方法 1. 1 材料 1. 1. 1 种子细胞 10～12个月龄健康比格犬，无菌穿刺抽取髂骨骨髓7～8 ml，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，进行原代、传代细胞培养。 1. 1. 2 支架材料 将PLGA支架(购自山东医疗器械研究所)剪成1. 0 cm×1. 0 cm×0. 2 cm大小的方块，放入12孔板内，然后经紫外线照射30 min消毒，备用。 1. 1. 3 受体动物及分组 10～12个月龄健康比格犬10只（购自山东大学动物实验中心），体重在8～10 kg。在每只犬的双侧膝关节分别制造3个骨软骨缺损区，随机分为3组。A组：实验组关节软骨缺损内深层植入MSCs复合PLGA支架材料，浅层植入经过诱导培养的软骨细胞复合PLGA支架材料，紧密压配；B组：阴性对照组，缺损内仅植入MSCs复合PLGA支架材料；C组：阳性对照组，缺损内不植入任何材料。 1. 1. 4 主要试剂 一抗：兔抗人Ⅱ型胶原抗体，二抗:山羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒，以上均购自武汉博士德公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 MSCs向软骨细胞定向分化 P1传代细胞培养至细胞铺满瓶底时，消化后调整细胞浓度，加入含TGFβ110 ng/ml、10％胎牛血清的低糖DMEM溶液诱导培养。 1. 2. 2 诱导MSCs的鉴定 （1）糖胺聚糖（GAG）检测（表1）。取传代培养第二代MSCs（P2），实验组加入TGFβ1诱导培养，对照组用常规培养液培养，待细胞长满全层时，胰酶消化，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔板每孔200 μl，继续加入含不同的培养液每孔200 μl，每组5孔，培养第3 d换液1次，第7 d（诱导培养后第15 d）时，取细胞培养上清液，以硫酸软骨素为标准品，紫外分光光度