体外顺铂诱导肝癌SMMC┐7721细胞凋亡时细胞信号转导因子活性变化论文.docVIP

　　体外顺铂诱导肝癌SMMC┐7721细胞凋亡时细胞信号转导因子活性变化论文 .freelgL-1顺铂作用肝癌SMMC-7721培养细胞48h可观察到明显的凋亡峰，72h免疫细胞化学染色发现胞质或（和）胞核中MAPKs（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK）及转录因子（JUN，CREB）均有明显表达.结论在体外顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中，MAPKs途径（JIN/SAPKs.freelaSMMC-7721cell;FCM;im-munocytochemistry Abstract:AIMToinvestigateactivitychangesofcellsignaltransductionfactors（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK，JUN，CREB）inapoptotichepatomaSMMC-7721cellinducedbyCDDP.METHODSUsingimmunocytochemistryandFCMmethods.RESULTSAftertreatmentgL-1，thereand/ornucleusfor72h.CONCLUSIONMAPKspathaSMMC-7721cellinducedbycisplatin. 0引言 细胞凋亡在多细胞、发生分化的动物发育过程中起到了很重要的作用［1］.虽然细胞凋亡在一些情况下被称为细胞自杀，但多数情况下需特殊介导物或条件诱导才可产生［2］.临床上常用的抗肿瘤药物，如顺铂、阿霉素等均可干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，最终导致细胞凋亡［3-6］.近年来，借助于分子生物学和遗传学手段，对凋亡产生的效应及调节机制特别是信号转导途径进行了进一步的研究，学者们逐渐认识到丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）参与了细胞凋亡的信号转导过程［7-9］.我们在实验中使用顺铂诱导肝癌SMMC-7721培养细胞凋亡，采用免疫细胞化学法观察MAPKs（JIN/SAPKs，p38MAPK，ERK）及转录因子（JUN，CREB）在肿瘤细胞凋亡时活性的变化，探讨MAPKs途径在化疗药物介导细胞凋亡过程中的重要作用. 1材料和方法 1.1材料人肝癌细胞株SMMC-7721由本校神经生物学教研室提供. 1.2方法细胞培养参照文献［10］. 1.2.1流式细胞光度术分析细胞凋亡参考近年来国内外对顺铂诱导肝脏肿瘤细胞凋亡的研究［11，12］，根据预实验结果，实验组以15mgL-1浓度顺铂作用SMMC-7721细胞（106mL-1）0～72h，以无药物处理的细胞为阴性对照组，加入等量培养液（100mLL-1胎牛血清的RPMI1640培养液）常规培养，按作用时间不同，分别收集细胞，经HBSS洗涤2次，加入-4℃700mLL-1乙醇固定过夜，离心收集细胞，再经HBSS洗涤后，依次加入膜穿孔剂，PI和RNase4℃染色30min，350目筛网过滤，Epics-profile流式细胞仪上进行DNA含量及细胞周期分析.每份标本测定（3～5）×103个细胞，采用多参数细胞周期分析软件拟合处理对标本进行细胞周期分析. 1.2.2免疫细胞化学染色6孔板上放入盖玻片3片/孔，用多聚赖氨酸25gL-1，37℃处理2h，灭菌水或PBS洗涤3次，在紫外灯下吹干，接种细胞，100～500个/片，处理组加入终浓度15mgL-1顺铂培养液，对照组加入等量细胞培养液，分别培养6，12和72h，在不同时间点将玻片上的培养液倾去，0.01molL-1PBS洗，加入pH7.4，40mLL-1多聚甲醛固定10min，0.01molL-1KPBS洗涤15min（5min×3次），再用3mLL-1H2O2（用800mLL-1甲醇配制）封闭玻片30min，以消除内源性过氧化物酶，结束后用0.01molL-1PBS洗3次（10min/次），然后依次加入兔抗Jnk，p38，CREB，ERK，Jun（用血清稀释液1500稀释4℃孵育48h），生物素化的羊抗兔IgG（1500室温12h）及ABC复合物（1500室温4h），以上每一步骤均用0.01molL-1PBS（pH7.6）洗涤，10min×3.最后在含有0.5gL-1DAB，5gL-1硫酸镍铵和0.1mLL-1H2O2和0.1mLL-1醋酸缓冲液冲洗（pH6.2）中呈色直至颜色适度为止，约需10～15min，玻片在室温下晾干，用甘油封片，在OlymmpusBH60显微镜下观察并照相. 2结果 2.1细胞形态学变化与对照组相比，SMMC-7721细胞在15mgL-1顺铂作用下，12h时开始出现凋亡的形态学的改变，24h凋亡细胞增多，48h凋亡细胞明显增多，72h伴有大量细胞死亡. 2.2