佛波酯对体外培养大鼠前庭上皮PKC表达的影响论文.docVIP

　　佛波酯对体外培养大鼠前庭上皮PKC表达的影响论文 .freelyristate13-acetate，PMA）诱导下大鼠前庭上皮的表达和分布特点.方法取新生大鼠椭圆囊，建立体外前庭器官培养模型，采用免疫组织细胞化学的方法，以PKCβ，γ抗体为标记物.freelin时表达最强，其后逐渐减少，45min仍高于正常（P 0.01）.PKCβ2不但位于细胞膜，而且在纤毛亦明显表达;PKCγ在PMA诱导后胞质表达增加.在毛细胞层和支持细胞层均有，主要位于毛细胞层.结论体外前庭器官培养在PMA诱导后，PKC各亚型激活的形式及程度不同. Keyyristate13-acetate Abstract:AIMToinvestigatetheexpressionofPKCβ，γofvestibularepitheliuminratsafterPMAtreatmentduringor-gancultureinvitrosoastoelucidatethebiologicalcharacter.METHODSThevestibularorgan ofacultureplateediumtogroe.Theexpres-sionsofPKCβ1，β2，andPKCγinedbyanti-PKCβ1，β2，andPKCγmunocytochemistry.RESULTSInthenormalculturedvestibularepitheliumofneentalgroups，PKClevelsinutes.Thenthelevelsdecreasedgradually，butat45minutestheyal.PKCβstainingembranes，PKCβ2，notonlystainedincellmembranesbutalsoincilia，PKCγstainingincreasedincellcytoplasm.CONCLUSIONDuringorgancultureinvit-ro，theexpressionsofPKCβ，γofvestibularepitheliuminratsafterPMAtreatmentincreased，ofPKCmayhavedifferentformsofanddifferentactiva-tion，isoformmayfunctiondifferently. 0引言 蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）是一类钙离子-磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号转导过程中起着十分重要的作用，其通过催化多种蛋白质上的ser/thr磷酸化调节细胞代谢、增殖、凋亡及分化.研究表明PMA可以刺激心肌细胞增殖［1］;能激活Raf-1-MEK-MAPK信号转导途径，引起ERK-2表达增加、细胞增殖［2］.我们在建立体外前庭器官培养模型的基础上，采用免疫组织细胞化学的方法，以PKCβ，γ抗体为标记物，检测在PKC活化剂佛波酯（Phor-bol12-myristate13-acetate，PMA）诱导后前庭上皮PKCβ，γ的表达变化和分布特点，以探讨PKC在内耳的生物学特性及意义. 1材料和方法 1.1材料新生2d的SD大鼠20只.雌雄不限，体质量（9.1±1.3）g，由第四军医大学实验动物中心提供.PKCβ1，2，γ亚型兔多克隆抗体（SantaCruz公司）、SABC试剂盒、DMEM培养液、HEPES，DAB显色试剂盒（武汉博士德公司），PMA（Sigma公司），LEICAQ570图形分析仪（德国LEICA公司），培养箱（美国Sheldon公司），Hank’s液按配方配制［3］. 1.2方法 1.2.1体外前庭器官培养模型的建立按照Lam-bert方法［4］，冷冻麻醉后，无菌条件下断头，置于冰的Hank’s液中，解剖显微镜下取出椭圆囊，去除耳石，移入鼠尾胶包被过的24孔培养板中，加入适量DMEM高糖培养液（含HEPES、胎牛血清及青霉素）［5］.放于37℃，50mL L-1CO2孵箱，每日在倒置显微镜下观察移植物色泽及培养液情况，隔日换液，1in后，40g L-1多聚甲醛固定12h，恒冷箱中OCT胶定向包埋标本，取与纤毛平行方向，LEICA恒冷箱切片机连续切片，厚度10μm. 1.2.3免疫组化染色采用SABC法.3mL L-1过氧化氢-甲醇室温30min，封闭内源性过氧化物酶;正常山羊血清封闭10min，甩去，不洗;一抗:PKCβ1，2，γ亚型兔多克隆抗体（1∶400，0.01mmol L-1PBS稀释）4℃冰箱过夜;二抗:生物化兔抗羊（1∶200），室温3h;SABC室温3h;DAB显色.以上步骤中间以0.01mmol L-1PBS缓冲液冲洗3次，