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基因工程(DNA重组技术):体外、定向、分子水平
基本工具:限制性核酸内切酶(限制酶)来自原核细胞,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
DNA连接酶: E·coliDNA连接酶(只黏性末端)
T4DNA连接酶(黏、平末端也可但效率低)
载体:质粒、入菌体的衍生物、动植物病毒
条件:①能在宿主细胞内稳定存在复制表达
②一种或多种限制酶切点
③标记基因(抗生素抗性基因、荧光基因)
基本操作程序:
1、目的基因的获取:(人工合成、体内提取)
①从基因文库获取
基因组文库 e.g.cDNA文库(部分基因文库) 大小 大 小 启动子 有 无 内含子 有 无 基因数目 某种生物全部基因 部分基因(基因选择性表达) 物种间基因交流 部分可以 可以(mRNA逆转录) ②PCR技术扩增目的基因:模板、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)、原料能量(dXTP)DNA分子—精子头,高尔基体—顶体,中心体—尾,线粒体—尾的基部的线粒体鞘,
其他物质—原生质滴向后脱落
2、卵子的发生:卵巢及输卵管
胎儿性别分化后:卵原细胞有丝分裂,并变成初级卵母细胞,被卵泡细胞包围形成卵泡
卵泡的形成和在卵巢内的储备在出生前(胎儿时期完成)
初情期后:初级卵母细胞——次级卵母细胞和第一极体——减二中期停——卵子、极体
马狗排卵 猪牛羊排卵 受精
卵子是否受精的标志:卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体
3、受精:输卵管内完成
(1)精子获能
(2)卵子的准备:达到减数第二次分裂中期
(3)受精:
顶体反应,释放顶体内酶,溶解卵丘细胞之间的物质,穿越放射冠、透明带,(精子触及卵黄膜的瞬间)透明带反应,精子外膜和卵黄膜相互融合(标志着精子入卵),卵黄膜的封闭作用精子尾部脱离形成雄原核,卵子减二完成,排出第二极体,形成雌原核,比雄原核小,核融合(标志受精卵的产生)
防止多精入卵:透明带反应 卵黄膜的封闭作用
4、胚胎发育:卵裂期(透明带内,有丝分裂,胚胎的总体体积并不增加,或略有减小)
(1)桑椹胚:细胞数目32个,全能细胞
(2)囊 胚:开始出现分化,内细胞团(胎儿);囊胚腔;滋养层细胞(胎膜胎盘)
孵化:透明带破裂,胚胎伸展出来
(3)原肠胚:内细胞团—外胚层、内胚层、中胚层,原肠腔
(二)体外:
1、体外受精:
(1)卵母细胞的采集:实验动物、猪、羊—促性腺激素处理超数排卵,输卵管中冲取
大牛:屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞;活体动物的卵巢中吸取卵母细胞
人工培养至减二中期
(2)精子的采集和获能:假阴道法、手握法、电刺激法
获能处理:培养法(人工配制的获能液);化学诱导法(一定浓度的肝素或钙离子载体溶液)
(3)受精:获能溶液或专用的受精溶液
2、胚胎的早期培养:
无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清
向受体移植或冷冻保存
3、胚胎移植:
(1)意义:充分发挥雌性优良个体的繁殖能力;大大缩短了供体本身的繁殖周期;良种畜群迅速扩大,加速了育种工作和品种改良;不受时间地域限制,节省购买种畜费用;胚胎冷冻保存品种资源和濒危物种
(2)基本程序:
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体,有健康的体质和正常繁殖能力的受体,供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理,用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②同种优秀公牛配种或人工授精。
③把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(冲卵),胚胎进行质量检查,向受体移植或放入液氮中保存。
④对受体母牛进行是否妊娠的检查。
(3)生理学基础:
①同期发情处理,为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在一定时间内处于游离状态,不与母体子宫建立组织上联系,可以胚胎收集。
③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应,胚胎可以在受体的存活。
④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但遗传特性在孕育过程中不受影响。
4、胚胎分割:
实体显微镜、显微操作仪
发育良好,形态正常的桑椹胚或囊胚(内细胞团均等分割)
5、胚胎干细胞(ES或EK细胞)
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