棉花氮高效基因型筛选及相关基因的克隆.pdfVIP

摘 要 目的：棉花是新疆最重要的经济作物之一。氮在棉花生长发育过程中具有重要的作用，而大 量的施用氮肥和较低的氮肥利用率，在提高棉花产量的同时，也带来了生产成本增加、土壤 资源退化及环境污染等一系列农业生产及生态环境问题。因此，筛选氮高效利用的棉花品种 （系），分析棉花不同基因型氮素吸收利用的生物学特性及其生理生化机制，充分挖掘氮高 效相关基因，培育氮高效利用的棉花品种，对提高棉花氮肥利用效率，节约资源，减少和控 制环境污染，最终实现农业的可持续发展具有重要的现实意义。 方法：本实验采用苗期水培的方法对新疆 33 个棉花品种（系）进行氮高效基因型的筛选， 在此基础上，以氮高效棉花品种新陆早 12 号为材料，采用 cDNA-AFLP 技术结合生物信息 学方法克隆棉花氮高效利用相关基因，利用生物信息学方法进行序列比对及功能初步预测， 为进一步研究该基因的功能奠定基础。 结果：1.采用苗期水培的方法对耐低氮棉花基因型的筛选指标进行分析，并对新疆 33 个棉 花品种（系）进行氮高效基因型的筛选。相对整株干重与相对氮积累量呈极显著正相关 （r=0.946** ，N=33 ，P0.01 ），与相对氮利用效率呈显著正相关（r=0.432* ，N=33 ，P0.05 ）， 说明相对整株干重可作为棉花苗期氮高效基因型筛选的主要指标，相对氮积累量和相对氮利 用效率可作为苗期筛选的辅助指标。根据不同棉花品种的耐低氮能力的不同，可将 33 个棉 花品种（系）划分为三种类型，其中新陆早 12 号等 6 个品种（系）的相对整株干重较高， 具有在低氮条件下积累干物质能力强，氮利用效率较高等特点，为氮高效棉花品种（系）； 炮台一号等 6 个品种（系）为氮低效棉花品种，其余 21 个品种（系）属于中间类型。 2. 利用 cDNA-AFLP 差异显示技术，分析氮高效棉花品种新陆早 12 号在低氮胁迫和正常氮 营养条件下基因的表达变化，从 64 对引物组合中共检测到 122 个差异表达的转录衍生片段 (TDFs)，对其中 51 个差异明显的 TDFs 进行了克隆。[0]获得其中 22 个克隆并进行了序列分 析。通过功能预测，结果表明，与植物光合作用有关差异片段为 7 个，与信号转导有关差异 片段为 6 个，与细胞膜通透性有关差异片段为 4 个，与细胞代谢有关差异片段为 1 个，与 离子的转换有关差异片段为 4 个。它们与毛果杨假性蛋白、光敏素、二硫键异构酶、糖基 转移酶同源性很高。 3.利用 RT-PCR 结合生物信息学方法克隆了与氮利用相关的二硫键异构酶（PDI ）基因全长 cDNA，其序列全长为 1484bp，其中 5′非编码区为 82bp，3′非编码区为 322bp，开放阅读框 长为 1080bp，编码 360 个氨基酸，将该基因命名为 GhPDI，序列登录号为ES802670.1 。将 该基因在 NCBI 中进行同源性比对[0]，与蓖麻的PDI 基因同源性为 88% 。对蛋白质结构预 测表明，GhPDI 基因所编码的蛋白质具有典型的 PDI 基因家族的蛋白质降解途径(ERAD)、 蛋白质转运途径，可初步断定其为PDI 基因。 结论：本研究采用植物营养学与分子生物学相结合，从改善棉花营养性状出发，通过苗期水 培方法对新疆 33 个棉花品种（系）进行氮高效基因型的筛选，在此基础上，采用 cDNA-AFLP 差异显示技术结合生物信息学方法从棉花氮高效品种（新陆早 12 号）中克隆了一个在低氮 I 胁迫下优先表达的二硫键异构酶基因的全长 cDNA 序列，并利用生物信息学方法进行了序 列比对及功能初步预测。 1、棉花不同基因型对氮素利用效率存在明显差异，采用苗期水培的方法，对棉花幼苗相对 整株干重、相对氮积累量、相对氮利用效率进行分析，可以简单、快速的对大量棉花种质资 源的耐低氮特性进行初步筛选。 2 、低氮胁迫下，棉花多个基因如与光合作用有关基因、与信号传导有关基因的表达均发生 变化，利用 cDNA-AFLP 技术结合生物信息学方法分离低氮胁迫相关基因可为研究棉花适应 低氮的分子机理及利用基因工程改良棉花品种奠定基础。 关键字：棉花；基因型；氮效率；二硫键异构酶（PDI ）；基因克隆 II Abstract Object: Cotton is one of the most impor