核酸信标配基的构建、合成、活性鉴定及检测技术的研究.pdfVIP

摘 摘 要要 摘摘 要要 随着科学技术发展，对分子检测技术的特异性、灵敏度有着更高要求。尤其是在临 床应用和基础研究中, 分子的定性和定量检测具有非常重要的意义。因此，探索新技术 或改进现有技术以提高分子水平的精确定量，突破检测技术这一瓶颈，是目前科研工作 的重中之重。 本课题研究目的是构建一个具有配体识别和信号扩增能力的检测分子。在核酸信标 配基的研究中，本文首次利用指数级富集配基进化技术 （SELEX）筛选到小鼠 IgG 抗体 Fc 片段的特异性寡核苷酸配基，并进行了克隆、测序、序列分析及采用多种方法进行特异 性鉴定，如：利用 PCR 进行阳性克隆筛选，dot-blot 阳性配基筛选，高压液相色谱，凝 胶阻滞等活性鉴定。共筛选到 16 株特异性配基克隆。同时，首次建立了一套较为完整的 SELEX 硝酸纤维素滤膜快速筛选方法。 在此基础上，本文首次发明了核酸信标配基，完成设计、合成及活性鉴定。核酸信 标配基是通过巢式-PCR 方法，在配基的 5 ’端连接一段荧光标记探针的靶 （Beacon）序 列，该序列是由两端两个引物和中间 Taqman 探针的互补序列构成，和靶分子具有对应性， 即双链核酸信息标记的核酸信标配基。由于核酸信标是双链，不影响配基和靶分子 （Fc 片段）的结合，因此通过核酸信标来完成信息传导和信号放大功能。本文首次利用琼脂 糖凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮兰双显色方法，对核酸信标配基和抗体结合特异性进 行鉴定。 另外，本文首次建立两种方法对核酸信标配基进行功能鉴定：一种方法是核酸信标 配基免疫－PCR 方法 （NBA-iPCR），该方法是通过核酸信标配基与抗体结合形成信标配基- 抗体复合物作为检测分子，再利用配基-抗体与抗原结合形成信标配基-抗体-抗原复合 物，完成抗原信号到核酸信号的传递。通过实时定量－PCR 检测证明，核酸信标配基具有 传感和扩增能力。另一种方法是核酸信标配基－PCR 方法 （NBA-PCR），该方法是将核酸信 标配基作为检测分子，通过核酸信标配基和靶分子 （抗体）结合形成配基-靶分子复合物， 完成靶分子信号到核酸信号的传递。通过实时定量－PCR 检测证明，核酸信标配基自身具 有配基和配体识别能力和信号放大功能。 综上所述：核酸信标配基完全具有适配体识别能力和信号储存、传递、放大功能。 该分子将成为一种全新的、构建灵活、检测特异性强、灵敏度高、使用范围广的检测分 子。 关键词： 分子配基信标，核酸信标配基，配基，SELEX，免疫－PCR Abstract Abstract AbstractAbstract The detection and quantification of molecules play an essential role in basic discovery research as well as in clinical practice. Technologies that allow specific detection and precise quantification of molecules are evolving to cater to new analyses as well as to improve existing techniques. As a result, novel approaches that challenge traditional methods are being discovered. We have designed a novel nucleic acid beacon aptamer, which can recognize target molecules with high affinity and specificity and transduction signal with high amplification potential of DNA replication in real-time quantitative PCR, for