果蝇原多本酚氧化酶原核表达及其活性检测研究.pdfVIP

摘要 昆虫原多酚氧化酶（prophenoloxidase，PPO）是一个重要的天生免疫蛋白， 它们的酶联激活反应已有大量文献报道，但是 PPO 蛋白家族的生化特性仍有许 多不清楚的地方，主要原因是难以得到足够的 PPO 蛋白。我们在原核细胞中成 功表达了果蝇的三个 PPO 蛋白，优化表达条件，调节了培养大肠杆菌诱导温度， 明显增加了可溶性重组蛋白的表达，使这些蛋白都具有活性，这项工作为后续的 实验奠定了基础。研究结果如下：  1．果蝇 PPO1、PPO2 和 PPO3都能在原核细胞中表达。37℃诱导的 PPO 比  16℃诱导的表达量高，但主要在包涵体中表达。16℃诱导时，约有一半目的蛋白 存在包涵体中，另一半以可溶性蛋白形式存在。通过 Western blot 检测，原核表 达的 PPO1 和 PPO3 分子量大小基本上与果蝇 S2 细胞系表达的一致，可能是它 们不需要翻译后再修饰或修饰较少；对 PPO2 而言，真核表达的蛋白比原核表达 的略大，可能PPO2 需要翻译后再修饰。  2．16℃诱导的 PPO 活性检测。表达 PPO 蛋白的细菌或其细菌裂解粗提蛋 白都可以用30%酒精或 0.02% CPC (cetylpyridinium chloride)激活。PPO1活性最 强，PPO3 次之，而 PPO2最低。对于 PPO1 和 PPO3，30%酒精比 0.02% CPC激 活效果明显；对于 PPO2，0.02% CPC 比30%酒精激活效果明显。  3． 随诱导时间增加PPO1 的表达量变化。 在 16℃诱导时， 在最初的 12 h 内， 随着诱导时间增加，表达量也增加，第 12 h 时表达量最高。  4. 30%酒精和铜离子处理先后顺序对 PPO1 的活性影响。结果表明：在检测  PPO1 的活性时，不论酒精和铜离子那种试剂先加，都可以检测到明显活性，但 先加铜离子后再用酒精激活比先加酒精后加铜离子的活性高。  5．纯化 PPO 蛋白与铜离子的剂量效应。原核表达后纯化果蝇三个 PPO 蛋 白，当培养基或溶液中没有铜离子时，它们都没有活性。对于 PPO1 和 PPO3， 铜离子浓度在 2­10 μM 时活性已经很高；对于 PPO2，铜离子浓度至少 100 μM  时，才有较高活性；当铜离子大于 500 μM 时，活性开始降低；达到 2000 μM 时， 几乎没有活性或很低。 本文建立的方法有利于今后对 3 种 PPO 蛋白特性和功能研究，有利于大量 表达和纯化昆虫特异的重组 PPO，而利用传统的蛋白纯化方法很难做到这点。 关键词 果蝇，原多酚氧化酶，表达，大肠杆菌， 激活 I  Abstract  Insect  prophenoloxidases  (PPOs)  are  a  group  of  important  innate  immunity  proteins. Although there have been numerous studies dealing with the PPO activation  cascade, the detailed biochemical behaviors of the PPO family proteins remain to be  clearly  established.  This  is  due primarily  to  the  difficulty  in  obtaining  adequate  amounts  of  PPO  proteins  for  comprehensive  characterization.  In  this  study,  we  expressed three Drosophila  melanogaster  PPO  genes  in E.  coli,  and  extensively  evaluated  expression  conditions  for  obtaining  soluble  proteins.  Through  the  manipulation  of  expression  conditions,  particularly