松材线虫携带荧光假单胞菌分泌毒蛋白的纯化及致病机理研究.pdfVIP

山东师范大学硕士论文 松材线虫携带荧光假单胞菌分泌毒蛋白的纯化 及致病机理研究 尹永华 (山东师范大学生命科学学院，济南，250014) 摘要 松材线虫病是松属树种的一种毁灭性病害，主要由松褐天牛传播，可危害多 种松属植物。由于其发生和发展涉及到松树寄主、媒介昆虫、松材线虫、相关的 微生物以及环境条件等多种因素，而这些因素之问相互构成了复杂的关系，故给 致病机理的研究和防治工作增加了难度。本文以松材线虫携带的荧光假单胞菌为 材料，从该菌的培养液中分离鉴定了其分泌的一种毒蛋白，并对其对黑松的毒性 进行了研究，以期为松材线虫病的致病机理研究提供参考。 过滤层析等方法从松材线虫携带荧光假单胞菌的LB培养液中分离纯化出一种分 白是鞭毛蛋白，体外该蛋白对黑松幼苗和悬浮细胞具有很强的毒性。该蛋白能改 变黑松悬浮细胞膜的通透性，导致胞内可溶性糖和游离氨基酸的外渗，并导致胞 内外过氧化物酶活性升高和新的同工酶的出现。此外，免疫细胞荧光分析表明， 鞭毛蛋白与黑松悬浮细胞之间存在直接的相互作用。因此，推测松材线虫携带的 荧光假单胞菌在寄主松树体内可分泌毒蛋白，并参与了松材线虫的致病过程。 本文还研究了离体情况下松材线虫携带的致病菌荧光假单胞菌在LB、NB和 PD三种培养基中的产毒情况。结果显示，该菌体在LB和NB液体培养基中培养 时所得培养液的毒性较高，在PD培养基中几乎不产毒素，其中LB培养液的毒 性最高，且培养基的pH为7时培养液的毒性高于p}I为5时的毒性。 体外人工合成了编码该蛋白的基因fliC，克隆到pAP3neo上，用Nde，和 coli 将表达质粒转入E BL21(DE3)构建工程菌，工程菌经IPTG诱导表达后， 破碎菌体，运用亲和层析、阴离子交换柱层析纯化重组蛋白。生测分析表明，该 蛋白与野生鞭毛蛋白有相似的毒性。 山东师范大学硕士论文 关键谲：松材线虫病：荧光假单胞毽：毒素：致病枫理 论文分类号：QTS 2 山东师范大学硕士论文 PurificationandMechanismontheToxins Study SecretedPseudomonasfluorescensCarriedPineWood by by Nematodes Yin Ybnghtla ofLife Normal 250014，Chma) (CollegeSciences，ShandongUnh堆礴i慨Jinan Abstract wiltdiseaseisonekindof diseaseto Pine lethal is speciesofPinus，which many woodnematodesdiffused Monochamus caused and mostly alternatus．The bypine by ofthisdiseaseis the and of mechanism still unknown,