实验DNA粗提取与鉴定.doc

实验 DNA的粗提取与鉴定 教学目的 初步掌握DNA粗提取和鉴定的方法。 观察提取出来的DNA物质。 实验原理 DNA在NaCl溶液中的溶解度是随NaCl的浓度变化而改变的。DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，据此可使DNA充分溶解而使杂质沉淀或DNA沉淀而杂质溶解。 DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA。 DNA对蛋白酶、高温和洗涤剂（可以溶解细胞的细胞膜，除去脂质和蛋白质，而对DNA没有影响）都具有较好的耐性。 DNA＋二苯胺蓝色（用于DNA的鉴定） 实验材料： 鸡血细胞液（5-10ml），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液(抗凝剂)，物质的量浓度分别为2mol/l和0.015mol/l的氯化钠溶液，二苯胺试剂 实验步骤 1．材料制备 0.1g/ml柠檬酸钠100ml 置于500ml烧杯内→玻璃棒搅拌→1000r/min离心2min→吸去上清液→即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀） 活鸡血180ml [思考]为什么要除去血液中的上清液？ 2．方法步骤 取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质 （1）提取鸡血细胞的细胞核物质 原理：血细胞吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂 （2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L） （4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上 （5）DNA粘稠物再溶解： 在50ml的烧杯中注入20ml 2mol/L的NaCl溶液，缓慢搅拌3 min使上述粘稠物尽量多的溶解在溶液中。 （6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋冷却的95%的酒精50ml，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。 （8）DNA鉴定： 【思考】1.上述过程中两次加入蒸馏水，两次加入的作用一样吗？为什么？ 2.用纱布过滤了几次？每次的目的是什么？（你要保留滤液还是纱布上的物质） DNA的直径约为2nm，实验中出现的丝状物的粗细是否就表示一个DNA分子直径的大小？ 【实验关键】 本实验成功的关键是获取较多、较纯净的DNA，因此应注意： 1．充分搅拌鸡血细胞液。DNA存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后，应用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，并释放出DNA 2．沉淀DNA必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至少存放24小时。 3．正确搅拌含有悬浮物的溶液。在第（3）、（5）步骤，玻璃棒不要直插烧杯底部，且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。在步骤（7），要将玻璃棒插入烧杯溶液中间，用手缓慢转动5-10min。 【补充】 １.也可使用菜花或洋葱做实验材料，只不过实验成功率较低，实验效果与研磨液关系密切。 （1）取新鲜植物组织（菜花）放置于冰箱中冷却1~2天 （2）取30克植物组织,切碎,置于研体中,倒入10ml研磨液,充分研磨10分钟 （3）将研磨液置于离心管中，在1000r/min的转速下离心2~3分钟，取上清夜置于冰箱中冷却几分钟 （4）取1倍体积的上清液，加入2倍体积的95%的冷酒精当中，用玻棒轻轻搅拌，沉淀3~5分钟后可见白色絮状DNA缠绕于玻棒末端。 （5）鉴定（略） 【思考】用菜花代替鸡血作为实验材料，其实验操作步骤完全相同吗？为什么？ 2.在学生实际的实验过程中，在水浴后15分钟内出现明显实验现象的比例往往非常低，经常会出现整个班级没有明显鉴定结果的现象。根据实际操作的结果，很可能的原因是： 在实验过程中，经常会出现缠绕于玻璃棒末端的DNA的量过少的情况，如果溶解于氯化钠溶液中的DNA的量过少的话，与过量的二苯胺试剂共热时，出现的蓝色会比较浅。 【总结】 1.提取生物大分子的基本思路是：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理化学性质的生物大分子。 2.破碎细胞获取DNA滤液的方法有：在鸡血细胞溶液中加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液；或者在切碎的洋葱中加入洗涤剂和食盐，