【2017年整理】ELISA的操作.docVIP

ELISA的操作与注意事项 阻断ELISA 液相阻断ELISA（代表试剂盒：口蹄疫O型、ASIAⅠ型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒：兰州兽医研究所生产） 1.1原理： ①兔抗口蹄疫血清+病毒抗原（被检血清与病毒抗原反应后病毒抗原剩余）+豚鼠抗口蹄疫血清+兔抗豚鼠酶标结合物+底物显色+终止液+读数（OD值，颜色越深OD值越大）。颜色的深浅与病毒抗原剩余量成正比，病毒抗原剩余多，则与之反应的被检血清的抗体效价低，反之，病毒抗原剩余少，则与之反应的被检血清的抗体效价高。因此，随着被检血清的递倍稀释，血清效价逐渐降低，与被检血清反应的病毒抗原剩余逐渐增多，颜色也逐渐加深。 ②兔抗口蹄疫血清+被检血清（被检血清与病毒抗原反应后被检血清剩余），则反应终止，以后加入的试剂随着洗板被清洗，最终无颜色反应，则说明被检血清抗体效价高。因此，反应颜色越浅则抗体效价最高，颜色的深浅也抗体的效价成反比。 1.2 操作过程 1.2.1提前一天准备工作： 稀释血清：使用血清稀释板（U型96孔板），常用稀释布局如下图：按图示加入相应量的PBST,吸取12.5ul被检血清和50ul阴、阳性血清于相应孔中，将待检血清和阴、阳性血清做2倍连续稀释，然后再加入50ul的病毒抗原对照，病毒抗原对照孔加入100ul病毒抗原对照，这时，除去空白孔，所有孔均为100ul体系。 96 孔 酶 标 板 20 份 检 测 样 品 布 局 图 　 样品稀 释倍数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 （+） 12 (-) A 1:16 1 87.5 2 87.5 3 87.5 4 87.5 5 87.5 6 87.5 7 87.5 8 87.5 9 87.5 10 87.5 1:16 50 1：4 50 B 1:32 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1:32 50 1：8 50 C 1:64 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1：64 50 　 D 1:128 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1：128 50 　 E 1:16 11 87.5 12 87.5 13 87.5 14 87.5 15 87.5 16 87.5 17 87.5 18 87.5 19 87.5 20 87.5 1：256 50 病毒抗原 　 F 1:32 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1：512 50 　 G 1:64 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1：1024 50 　 H 1:128 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1：2048 50 　 ② 包被ELISA板（平底96孔板）： 用包被缓冲液稀释口蹄疫兔抗血清至工作浓度，将稀释后的口蹄疫兔抗血清加入ELISA板中，每孔加50ul,震荡后使包被液布满整个孔底，封板，在室温条件下过夜。 1.2.2 第二天工作（严格按说明书操作） 洗ELISA板→转移血清稀释板上的病毒抗原与血清反应液（按照稀释血清布局图的格式相应的转移至ELISA板上）→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的豚鼠抗血清→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的兔抗豚鼠酶结合物→孵育60分钟→洗ELISA板→加入底物（现加入相应量的H2O2） 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 － 5 13 21 29 37 45 53 61 69 77 85 － 6 14 22 30 38 46 54 62 70 78 86 + 7 15 23 31 39 47 55 63 71 79 87 + 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 2 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91 2.3结果判定 2.3.1试验成立条件 ①阴性对照OD450平均值-阳性对照OD450平均值≥0.6 ②阳性对照阻断率≥55% 2.3.2阻断率的计算 Inh%=(阴性对照OD450平均值-样品孔OD450值)/ 阴性对照OD450平均值*100% 2.3.3 结果判定 ①猪血清样品 被检样品Inh%≥30%，判为阳性；被检样品20%≤Inh%≤30%，判为可疑；被检样品Inh%＜20%，判为阴性。 ②牛羊及其他动物血清样品 被检样品Inh%≥40%，判为阳性；被检样品25%≤Inh%≤40%，判为可疑；被检样品Inh%＜25%，判为阴性。