07 外源基因的表达及其优化策略.ppt

三、真核表达的受体系统 （二）昆虫表达系统 　　1、昆虫表达系统的缺点 　　　1. 载体大量复制，最终导致宿主细胞或幼虫死亡，不能连续生产外源蛋白。 　　　2. 昆虫细胞对蛋白产物的糖基化方式与哺乳动物有所差异，可能影响到产物蛋白的活性和免疫原性。 　　　3. 昆虫细胞的大规模培养费用大。 　三、真核表达的受体系统 （三）哺乳动物细胞表达系统 　　　哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化和准确的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。 　根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。 　三、真核表达的受体系统 （四）植物表达系统 　　　以植物个体、果实或器官作为生物反应器,将目标基因与植物病毒或特定的植物调控元件构建融合基因,以此制造转基因植物,目标基因将在预定时期和部位表达。该系统在启动期需较大资金投入,一旦获得预期的转基因植株,便可以极低的成本进行大规模的生产。其缺憾为产物的翻译后修饰与动物有些不同,这限制了其应用范围。美国一家公司已用转基因香蕉生产出了疫苗。 主要基因工程表达体系比较 表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性 大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大 融合蛋白质 部分高产 对真核差 酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物 哺乳动物 完 整 外分泌 较难成本高 简单 可达天然 需注意 糖基化蛋白 可高产 产物 致癌 作业六： 查文献，了解植物转基因工程的现状与转基因安全评价机制，你认为食用转基因植物产品是否安全？ OVer!!!! * ORF(open reading frame)：起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 * ORF(open reading frame)：起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 * 一段长约数百碱基对，能够妨碍真核基因调节蛋白对远距离的基因施加影响的DNA序列。可以缓冲异染色质的阻遏作用，当其位于基因及其调控区旁侧时，该基因不论其在基因组中位置如何都能正常表达；当其位于靶基因的增强子与启动子之间时，可以阻断增强子的作用。 绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。 * 操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。 * 每个核糖体可独立完成一条多肽链的合成，即这种多核糖体可以同时在一条mRNA链上合成多条肽链，大大提高了翻译效率。 因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后，其中内含子部分不能被切除。 对RNA合成的控制有2种方式：一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。 * * ⑴ 载体能够独立复制，具有复制起点。 ⑵ 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。 ⑶ 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。 ⑷ 应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 ⑸ 应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。 ⑹ 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。 * 内终止子（ intrinsic terminator）：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。 * 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋 白质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的