凝胶电泳及其应用分析.ppt

* 凝胶电泳及其应用 主要内容 凝胶电泳相关概念 1 凝胶电泳的原理 2 凝胶电泳的应用 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 *  凝胶：凝胶是胶体体系的一种存在形式，它是由胶体体系中分散相颗粒相互联结，搭成具有三维结构的骨架后形成的，具有空间网状结构体系，胶体体系中原有的分散介质（液体）充填在网状结构的空隙之中。 电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 分类： 凝胶电泳相关概念 自由电泳（无支持体） 区带电泳（有支持体） Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。 滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等 凝胶电泳原理 当一种分子被放置在电场当中时 , 它们就会以一定的速度移向适当的电极 , 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 , 叫做电泳的迁移率。 它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说 ,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多 ,其迁移的速度也就越快 , 反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质 , 如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等 , 从而降低了对流运动 , 故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数 , 因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异 , 以及所带的净电荷的多少 , 便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。 凝胶电泳原理图 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。 凝胶电泳装置图 垂直式电泳装置 水平式电泳装置 影响凝胶电泳的因素 影响电泳速度的因素： 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度 凝胶电泳应用 凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子。 凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学。 大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行（SDS），现以其为例进行实验说明。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N， N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂（四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 （polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置图 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 操作过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好 聚丙烯酰胺凝胶电泳确定蛋白质分子量 配 胶 分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml) ddH2O 4.05ml 6.8ml 30%Acr 3.3ml 1.7ml Buffer 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml 10%SDS 100μl 100μl 10%Ap 50μl 100μl TEMED 10μl 10μl 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置至胶凝  4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝。 5.拔出样梳后, 在槽中加入缓冲液 6.上样：（微量注射器） （1）marker 5μl （2）样品10 μl + 2×上样buffer 10μl 共20μl  7.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳。 8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右。 9.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 10.实验结果分析 *