COX2和VEGF与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系论文.docVIP

　　COX2和VEGF与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系论文 姚煜，田涛，崔洁，赵娜，郭亚焕，南克俊 【摘要】 目的： 探讨COX2和VEGF在肝癌多细胞球体（MCS）中的表达与肝癌群集耐药的关系. 方法： 以liquid overlay技术获得肝癌HepG2多细胞球体为模型，采用透射电镜和扫描电镜比较单层细胞与MCS的形态学差异；采用MTT法和流式细胞技术比较ADM和5FU对单层细胞和MCS的生长抑制率和细胞凋亡率；采用免疫组化和图像分析技术比较COX2和VEGF在单层细胞和多细胞球体表达的差异. 结果： 与单层细胞相比，多细胞球体细胞间黏附广泛而紧密.freelulticellular spheroids，MCS）对阿霉素（adriamycin，ADM）和5氟脲嘧啶（5fluorouracil，5FU）的耐药性以及环氧化酶2（cyclooxygenase2，COX2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial groulticellular resistance，MCR）中的表达的关系，探讨肝癌MCS的耐药机制. 1材料和方法 1.1材料人肝癌HepG2细胞购自美国ATCC，由本室保存；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；噻唑兰（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；Annexin VFITC试剂盒购自晶美生物公司；COX2鼠抗人mAb和VEGF鼠抗人mAb购自Santa Cruz公司. 透射电镜（Hitachi，H600）；扫描电镜（JEOL，JSM840）；高通量多功能微板测试系统（BMG，PolarStar OPTIMA）；流式细胞仪（BD，FALS Calibar）；图像信号采集与分析系统（Leica，Q550CCS. 1.2方法 1.2.1细胞超微结构观察取平面细胞和MCS，置于25 g/L戊二醛固定液中4℃固定2 h，10 g/L四氧化锇固定液4℃后固定2 h，乙醇梯度脱水，置换，切片，喷金后用透射电镜和扫描电镜观察. 1.2.2细胞抑制率的检测将细胞接种于96孔板中，在不同浓度ADM和5FU作用48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续孵育4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO振荡5 min，于492 nm波长处检测每孔A值，以不加药物组为空白对照，计算细胞抑制率. 细胞抑制率（%）=［(1-实验组A值)/对照组A值］×100%. 1.2.3细胞凋亡的检测单层细胞和MCS分别经不同浓度ADM和5FU作用48 h后收集，按照试剂盒说明书加入Annexin VFITC和PI，避光染色15 min后，上机检测细胞凋亡率. 1.2.4检测COX2和VEGF的表达单层细胞制作细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定20 min后备用. MCS 40 g/L多聚甲醛固定1 h后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片后备用. 根据试剂盒说明进行免疫组化染色，阴性对照用PBS代替一抗. 用Leica Q550c左右(图1C)，细胞间黏附广泛而紧密，可见桥粒连接和中间连接（图1D）. 2.2单层细胞和MCS细胞抑制率的比较MTT实验结果表明，除0.15625 mg/L组以外，经0.3125，0.625，1.25和2.5 mg/L的ADM作用48 h后，MCS的细胞抑制率低于单层细胞（P 0.05，图2A）；经6.25，12.5，25，50和100 mg/L的5FU作用48 h后，MCS的细胞抑制率低于单层细胞（P 0.05，图2B）. 2.3单层细胞和MCS细胞凋亡的比较经0.5，1.0，2.0 mg/L ADM作用48 h后，MCS的细胞凋亡率低于单层细胞（P 0.05，图3A）；经40和80 mg/L 5FU作用48 h后，MCS的细胞凋亡率低于单层细胞（P 0.05，图3B）. 在20 mg/L 5FU组两者的细胞凋亡未见明显差异. A: 扫描电镜下单层细胞形态（×1000）; B: 透射电镜下单层细胞形态（×3000）; C: 扫描电镜下MCS形态（×370）;D: 透射电镜下MCS形态（×60 000） 2.4COX2和VEGF的表达差异COX2和VEGF主要在胞质表达，呈棕黄色颗粒，对表达阳性的样本进行图像分析，测平均灰度值作为表达强度的量化指标. 将单层细胞培养成MCS时，COX2和VEGF的表达均增高（P 0.05）：单层细胞COX2的灰度值为190.8±9.4，MCS的平均灰度值为153.9±10.2；单层细胞VEGF的灰度值为207.4±8.8，MCS的灰度值为186.8±13.9. 光镜下观察，单层细胞COX2和VEGF仅个别细胞有弱的染色，而MCS大部分细胞有较强的染