MAPK途径磷酸化在胰岛素样生长因子1促进人骨髓瘤细胞株KM3增殖中的作用论文.docVIP

　　MAPK途径磷酸化在胰岛素样生长因子1促进人骨髓瘤细胞株KM3增殖中的作用论文 王华芳，胡豫，孙春艳，王雅丹 【摘要】 本研究探讨胰岛素样生长因子1（IGF1）对人骨髓瘤细胞株KM3增殖的影响以及MAPK途径磷酸化在该过程中的作用。采用流式细胞术检测不同浓度的重组人IGF1处理后KM3细胞周期的变化，APK信号转导途径主要分子Erk1/2磷酸化在IGF1刺激及PD98059特异性抑制作用下的改变， TUNEL法检测特异性阻断Erk1/2磷酸化在抑制KM3细胞增殖和诱导凋亡中的作用。 结果表明， IGF1可以显著提高S期和G2/M期的KM3细胞比率和细胞内Erk1/2分子的磷酸化水平，阻断IGF1引起的Erk1/2磷酸化可以显著抑制KM3细胞的增殖并引起其凋亡。结论： IGF1引起的Erk1/2分子磷酸化在KM3细胞增殖过程中起着十分重要的作用。 【关键词】 骨髓瘤 Effect of MAPK Signaling Patha Cell Line KM3 by Insulinlike Groyeloma cell line KM3 and the role of MAPK pathetry. PhosphorateErk1/2, the key molecule of MAPK pathined by 3 cells being pretreated e intensive portant role in the proliferation of myeloma cell line KM3. Key ultiple myeloma 多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）在恶性血液系统疾病中发病率居第二位.freelitogenactivated protein kinase, MAPK）信号途径在IGF1促进MM细胞增殖中的作用。 材料和方法 细胞培养 人多发性骨髓瘤细胞株KM3由上海第二军医大学侯健教授惠赠，用含10% 小牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/L链霉素的DMEM，在37℃、 5 % CO2、饱和湿度条件下培养。 试剂与实验分组 重组人IGF1从Gibco公司购得，分别用无血清细胞培养液稀释成不同浓度的母液保存；抗人Erk1/2磷酸化抗体购自Santa Cruz公司；酪氨酸蛋白磷酸化酶抑制剂PD98059购自Sigma公司。 细胞周期检测 2×104/ml对数生长期细胞接种于6孔培养板中。37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24小时后，换用无血清培养液培养24小时，再加入10、20、40和100 ng/ml 4个不同浓度的IGF1，每种浓度重复3孔，并设阴性对照，继续培养48小时后收获细胞，用PBS洗涤2次，用75%冷乙醇重悬，4％保存固定过夜。用PBS再次洗涤2遍后，用2 ml PBS重悬，加10 mg/ml的RNA酶A 200 μl后于37℃水浴30分钟，加100 μg/ml的碘化丙啶400 μl混匀，4℃避光反应2小时后进行流式细胞仪分析（FACS），检测波长488 nm。 Erk1/2磷酸化检测 对数生长期的KM3细胞约5×106/瓶，实验前1天换成无血清培养液培养，以减少血清中各种细胞因子对结果的影响。同细胞周期检测方法，刺激KM3细胞10分钟后收获细胞，未加IGF1组作为空白对照，阴性对照组中分别加入Erk1/2磷酸化特异性阻断剂PD98059预处理细胞24小时，使其终浓度为50 μmol/L。收获细胞在加入裂解缓冲液（RIPA buffer）后，置冰上裂解20分钟， 4 500×g 离心10分钟，取上清，用Bradford法测定蛋白浓度。每组取40 μg蛋白，与Laemmli样品缓冲液混合后，煮沸5分钟后上样，以12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗，37℃孵育1小时，用含0.5% Tol/L 4组浓度PD98059预处理KM3细胞24小时，再以40 ng/ml 的IGF1作用10分钟后收获并固定细胞。TUNEL细胞凋亡检测按照说明书进行。每个浓度组取3个独立的实验标本，每张切片随机计数100个细胞，根据TUNEL阳性细胞计算细胞凋亡率。 统计方法 检测数据以±SD表示，应用SPSS 13.0软件对结果进行统计学分析。 结 果 IGF1对细胞周期的影响 KM3细胞经10、20、40和100 ng/ml IGF1处理48小时后，对其细胞周期分析发现，随着IGF1浓度的增加，G0/G1期细胞的百分比降低，而S期和G2/M期细胞百分比逐渐增加；10和20 ng/ml组与40 ng/ml和100 ng/ml组之间的差异具有显著性（p 0.