RTPCR检测人膀胱上皮细胞双功能氧化酶表达论文.docVIP

　　RTPCR检测人膀胱上皮细胞双功能氧化酶表达论文 耿会珍 刘明岩 赵丽君 刘珍 刘燕翔 黄宁 王伯瑶 吴琦 【摘要】 目的：检测人膀胱上皮细胞(T24细胞)是否表达双功能氧化酶(Duox1、Duox2)，并观察炎症细胞因子及佛波酯(PMA)对基因表达水平的影响。方法：体外培养人膀胱上皮(T24)细胞，经佛波酯(PMA)、炎症细胞因子(TNFα及IFNγ)刺激后提取细胞总RNA，采用半定量RTPCR方法观察细胞Duox1，Duox2 mRNA表达水平。结果：Duox1，Duox2 mRNA在T24细胞中组成性表达，在佛波酯(PMA)、TNFα及IFNγ作用下，Duox2基因表达水平明显增加.freela公司，细胞因子(TNFα、IFNγ)为PeproTech公司产品，Trizol试剂购自Invitrogen 公司，逆转试剂盒购自MBI公司，Taq mix DNA聚合酶，DL2000 DNA Marker为天根生物技术有限公司产品，PCR引物由Invitrogen 公司合成。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养及刺激 T24细胞采用含有10%新生小牛血清的1640培养基(无抗生素)常规培养和传代。实验前在每个细胞培养皿(60×15mm)中接种30万个T24细胞，37℃ 5%CO2孵箱培养24h。加入PMA(浓度为5nM)或细胞因子(TNFα 20 ng·ml-1+IFNγ 20 ng·ml-1)，分别在刺激后的12、24h收集细胞抽提RNA。实验同时设无刺激的空白对照组。 1.2.2 PCR引物设计 根据GenBank 的序列，用Prime5.0软件分别设计Duox1(登录号AF213465)，Duox2 (登录号AF267981)，βactin (登录号BC016045)的引物。 表1 PCR引物序列 基因上游引物下游引物片段长度(bp)Duox15cgacattgagactgagttga 35ctggaatgacgttaccttct3106Duox25aacctaagcagctcacaact35cagagagcaatgatggtgat3109βactin5cgggaaatcgtgcgtgac35tggaaggtggacagcgagg34431.2.3 总RNA提取 按Trizol试剂说明操作。贴壁T24细胞直接用Trizol试剂裂解，提取的总RNA用异丙醇沉淀，溶于经过DEPC处理的水中，紫外分光光度计检测其含量及纯度。 1.2.4 逆转录反应 在0.5 ml的Eppendorf 管中加入 RNasin 0.5μl，Oligo (dt) 1μl，总RNA 1μl，MgCl2 4μl，10(buffer缓冲液2μl，逆转录酶1μl，用DEPC处理过的水补足至总体积20μl ，混匀，42℃反应40min，95℃ 5 min 终止反应，冰浴冷却5min，-70℃保存。 1.2.5 PCR扩增Taqmix酶12.5μl，cDNA2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，加水补足总体积25μl。Duox反应程序：94℃ 10min，94℃ 45s，53℃ 45s，72℃ 1min，40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。βactin反应程序：94℃ 3min，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1min, 27个循环，72℃ 5min，4℃保存。 1.2.6 PCR产物的鉴定 取5μlPCR产物，加1μl 6×lodding buffer，以1×TAE电泳缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上电泳约60min，BioRad凝胶图像分析仪拍照，Quantity One分析软件对PCR扩增产物的特异性条带进行灰度扫描，以βactin产物作校正分析，计算目的基因与内参照βactin灰度比。 1.3 统计学处理 利用SPSS软件13.0对数据进行统计学处理。 2 结果 2.1 总RNA的鉴定 实验提取的细胞总RNA用紫外分光光度计检测OD260/OD280比值在1.79-1.90之间，表明所提RNA的纯度较高，蛋白质和DNA污染少。从凝胶电泳上可以清晰看到28sRNA和18sRNA两条带(图1)，其亮度之比约为2∶1，5sRNA带不明显，表明RNA没有降解。 2.2 RTPCR扩增结果 PCR扩增结果显示Duox1，Duox2在T24细胞中有组成性表达(Constructive expression)。佛波酯(PMA)刺激后，Duox1基因表达无明显改变，而Duox2基因表达增加，并以细胞刺激后12h表达量最高，与未刺激对照细胞相比增加4.5倍(P 0.05)(图2)。 3 讨论 吞噬细胞(中性粒细胞、单核/巨噬细胞)杀菌机理研究揭示