Tricine系统检测低分子量蛋白酶抑制剂的电泳方法研究论文.docVIP

　　Tricine系统检测低分子量蛋白酶抑制剂的电泳方法研究论文 廖海 周嘉裕 高冬梅 黄丹娥 靳晓娥 李利平 【摘要】 目的建立一种能够检测不同分子大小（尤其是低分子量）蛋白酶抑制剂的电泳方法。方法根据特异蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶活性的原理，借助明胶-Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，胶板经蛋白酶水解后，以考马斯亮蓝染色。结果小分子量的胃蛋白酶抑制剂与较大分子量的BBI均能在该方法中显示出活性带，并且利用该方法检测到山合欢种子中含有一种胰蛋白酶抑制剂。结论该方法能够满足不同分子大小、不同类型蛋白酶抑制剂检测的需要。山合欢胰蛋白酶抑制剂的发现对山合欢进一步的研究和综合开发有重要意义。 【关键词】 山合欢 Tricine系统 蛋白酶抑制 电泳 Abstract：ObjectiveTo establish an detecting method for protease inhibitors, especially for loolecular-ples . After electrophoresis, the gel olecular-an-Birk inhibitor) onstrated by this method and shoethod, a trypsin inhibitor the seeds of Albizzia kalkora (Roxb.) Prain. ConclusionThis method not only fit for inhibitors olecular mass, but fits for inhibitors portant for further research and overall exploration. Key ； Protease inhibitor; Electrophoresis 蛋白酶抑制剂是一类可以抑制靶蛋白酶水解活性的功能多肽，参与体内许多重要生理过程的调节，广泛存在于豆科、禾本科及葫芦科等植物的种子及块茎中［1］。此外,动物的血液、精液、胰脏中以及酵母菌、链霉菌属等微生物中亦有蛋白酶抑制剂的存在［2］。蛋白酶抑制剂具有抗炎抗感染的能力，已被广泛用于治疗急性胰腺炎.freelide、Bisacrylamide、胰蛋白酶、甘氨酸、Tris、Tricine、胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A，分子量为685 Da)为Amresco.产品；胃蛋白酶、大豆Boan-Birk蛋白酶抑制剂(BBI，分子量为8800 Da)为Sigma产品；其余试剂均为国产分析纯。 2 方法与结果 2.1 山合欢蛋白酶抑制剂粗提物制备按Genov等［7］的方法略加修改。山合欢种子(20 g)打磨成粉，加入200 ml去离子水，室温搅拌提取2 h，离心(6 000 ×g，20 min, 4℃)，沉淀再用100 ml去离子水抽提1次，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，合并2次上清液。加固体硫酸铵至35%饱和度，4 ℃静置过夜，离心(6 000 ×g，20 min，4 ℃)收集上清液。上清液加入固体硫酸铵至55%饱和度，4 °C放置2 h，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，收集沉淀，用少量去离子水溶解，对去离子水充分透析，离心(10 000 ×g，10 min，4℃)，所得上清液即为山合欢蛋白酶抑制剂粗提物，置-20 °C下储存。 2.2 合欢蛋白酶抑制剂粗提物抑制活力的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford法［8］，以牛血清白蛋白为标准蛋白。抑制活力按照Erlanger等人的方法［9］，以实验条件下，与不加抑制剂的样品的吸收值比较，每降低0.1个A410 nm的吸收值为一个抑制活性单位。 实验结果：由20 g山合欢种子可以制备得到14 ml粗提物，用Bradford法测定蛋白质含量为0.5 mg·ml-1，测定对胰蛋白酶的抑制活力为202 单位/mg蛋白。实验结果表明山合欢粗提物中含有胰蛋白酶抑制剂。 2.3 明胶-SDS明胶-SDS采用Hanspal等［10］的方法略加修改，分离胶浓度12%(pH 8.8)，分离胶中含有0.2% ( Tris-HCl，pH 8.0，50%甘油，0. 05%溴酚蓝。样品与样品处理液按2∶1比例混合。电极缓冲液为25 mM Tris，250 mM甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS。电泳完毕后，胶板经去离子水冲洗3次，置于2.5% Triton X-100溶液中复性25 min（两次）。用去离子水冲洗胶板多次，将含有BBI和山合欢粗提物的电泳胶条置于胰蛋白酶酶解缓冲液中，另将含有Pepstatin A的电泳胶条置于胃蛋白酶酶解缓冲液中，37 °C水浴保温30 min，再用考马斯亮蓝R-