口蹄疫病毒直接实时荧光RT―qPCR检测方法建立.doc

口蹄疫病毒直接实时荧光RT―qPCR检测方法建立 　　摘要：根据口蹄疫病毒VP1基因保守序列，设计出1对口蹄疫病毒引物FMD-F、FMD-R及特异性探针FMD-Pb序列，建立了一种简便、快速、高效的口蹄疫病的直接实时荧光RT-qPCR（dRT-qPCR）检测方法。结果表明，在特异性方面，对口蹄疫病毒7个血清型的检出率100%；在灵敏度方面，其与常规提取RNA方法对比，阳性检出率差别很小；在对133份未知样本检测方面，dRT-qPCR方法检出阳性88份，常规方法检出阳性84份。dRT-qPCR方法的检测结果更可靠，适于对大量样本进行检测 关键词：口蹄疫病毒；直接实时荧光RT-qPCR；特异性；诊断检测 中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1165-04 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.043 Abstract：According to the Foot-and-Mouth disease virus （FMDV） VP1 gene conserved sequence，primers （FMD-F， FMD-R） and specific probe（FMD-Pb） were designed respectively. FMDV was detected fast and conveniently by directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）. The results showed that the detection rate of 7 serotype of FMDV by dRT-qPCR was 100%. Moreover， there wasnt significantly difference between dRT-qPCR and conventional method. In the unknown-sample-detection， by dRT-qPCR method， 88 positive samples could be detected in the 133 unknown samples， while only 84 positive samples were detected by conventional method. dRT-qPCR method， with rapid， accurate， specific and sensitive advantage， can be used for the diagnosis detection and real-time monitoring of FMDV. Key words：Foot-and-Mouth disease virus； directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）； specificity； diagnosis detection 口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）是口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）的病源体，能够感染猪、牛、羊等偶蹄兽引起急性、烈性、接触性传染病[1]。研究表明，感染口蹄疫病毒的牲畜常呈现进食量下降，机体抵抗力和免疫力降低，并容易继发其他病毒性疾病和细菌性疾病，从而造成受感染动物的生产性能下降，危害畜牧业正常生产和发展[2]。世界动物卫生组织（OIE）将口蹄疫列为必须报告的动物传染病，中国将其归为一类动物疫病[3] FMDV共有7个血清型，即C型、A型、O型、 Asia Ⅰ型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型和SAT Ⅲ型，每个血清型又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫，使得口蹄疫的诊断和控制更加困难[4]。目前，口蹄疫病毒感染的特异性诊断技术包括病原学、免疫学、分子生物学等6种方法[5]，即病毒分离法、血清学检测技术、免疫荧光法、酶联免疫吸附（ELISA）以及反转录聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcriptase PCR，RT-qPCR）和基因芯片技术。病毒的分离培养、血清学检测、免疫荧光法、酶联免疫吸附（ELISA）法存在耗时长、阳性检出率低、敏感性较差、不易标准化等缺点[6]，在实际应用中具有一定的局限性，无法满足大量样本的快速诊断。反转录聚合酶链（RT-qPCR）的检