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关于肉毒梭菌毒素的研究进展 （甘肃农业大学动物医学院动物医学专业，甘肃兰州，730070） 前言 肉毒毒素是肉毒梭菌产生的一种神经毒素，能够通过抑制神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放而引起肌肉麻痹。肉毒毒素在培养液中以复合物形式存在，其中的毒性组分由3个非同源性结构域组成，是一种新型的金属蛋白酶。不同血清型的肉毒毒素能够特异性地作用于不同底物，这些底物在神经细胞的胞外分泌过程中发挥重要作用。肉毒毒素在胞吞胞吐机制的研究以及临床医学应用方面具有宝贵的价值。 正文 肉毒梭菌（Clostrdium botulium）是一种革兰氏阳性厌氧芽胞梭菌，其产生的肉毒毒素能引起人畜严重的中毒症状，甚至导致死亡。肉毒梭菌具有厌氧生长、低温生长产毒的特点，使其在日益普及的真空包装、冷冻食品及罐装食品中具有生长优势，从而成为这类食品中毒的主要原因之一。此外，肉毒毒素的神经毒作用，在当今肌肉痉挛、腺体分泌过度以及美容外科领域中正被广泛利用。因此，对肉毒梭菌的研究引起了广泛关注，研究的重点主要集中在肉毒毒素的相关领域，近年来，毒素的研究已经取得了长足的进步。 1 毒素基因簇及其调控 组成肉毒毒素复合物的蛋白编码基因通常成簇排列，不同的血清型、不同的株，其基因簇的组成和排列也不完全相同，A1型毒素基因簇的排列就有两种不同的方式。毒素基因簇位于A、、、、）、、、、μg的毒素就可导致成人中毒死亡。 人类肉毒中毒主要有3种类型:①食物性肉毒中毒，主要是由于进食了含有肉毒毒素的食品引起，也是人类肉毒中毒最兴遍的一种形式；②婴儿肉毒中毒，由于新生儿正常肠道菌群缺乏，其食入的肉毒梭菌芽抱可以萌发、繁殖、产生毒素，从而引起婴儿中毒;③创伤性肉毒中毒，类似于破伤风，由于伤口处污染的肉毒梭菌芽孢繁殖、产毒，毒素从伤口进入叔液循环而导致，比较少见。 3 毒素的作用机制 前体毒素中的非毒素组分可以在人畜的消化过程中保护神经毒素免受各种酶的消化以及胃酸的侵蚀。进入小肠后，小肠内的微碱性环境导致毒素复合物的解离， Bont穿过小肠表皮，进入血液和淋巴循环，进而作用于神经肌肉接头（NMJ）阻止神经递质乙酞胆碱（ACh）的释放，引起肌肉麻痹。有关Bont对神经肌肉接头的作用机制被研究得较详细，主要包括以下4个步骤。 ①靶细胞的识别与结合 Bont通过其HC结构域结合于胆碱能神经元的突触前膜。靶细胞的识别与结合需要神经节苷脂的存在，特别是GD1b、GT1b和GQ1b。然而，神经节苷脂分布及对毒素亲和结合能力的研究表明，神经节苷脂不是促进毒素结合的惟一分子，细胞表面的蛋白质也参与了这个过程。于是Montecucco等提出了毒素结合的“双受体(double-receptor)模型:肉毒毒素及破伤风毒素与靶细胞的特异性牢固结合同时需要毒素与神经节苷脂、毒素与蛋白质受体间的相互作用。对A型、B型、E型毒素的研究发现靶细胞表面的突触结合蛋白质Ⅱ参与了毒素的识别结合过程，并且在神经节苷脂存在的条件下对毒素的亲和力明显增强，为“双受体”模型提供了有力证据。 ②内化 由于肉毒毒素是在神经元细胞的胞质中发挥作用，毒素分子就必须首先进入细胞质中，这个过程就是内化过程（internalization）。毒素结合于细胞表面后，不是直接从细胞膜进入，而是通过细胞的内吞，形成一个包裹毒素分子的酸性小泡。研究表明，毒素结合于神经细胞表面后，这种受体介导的内化过程是温度和能量依赖的，神经刺激能够加快这一过程。 ③跨膜转运 与破伤风毒素不同，肉毒毒素形成的这种酸性小泡并不逆行进入脊髓，而是滞留在运动神经元的突触前膜末端。小泡内的酸性环境使Bont分子构象发生变化，中性环境下埋藏在内部的疏水片段暴露于分子构象表面，使得毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双分子层内。毒素嵌入质膜后形成离子通道，这种离子通道是阳离子选择性的，相对分子质量小于700 000的分子可以通过这个通道。目前兴遍认为毒素轻链从小泡腔内转运到神经细胞胞质的过程与这种离子通道的形成密切相关，但具体过程没有形成一致看法，共有3种轻链转运假说模型：管道模型、裂缝模型和裂解模型。 对于离子通道的形成，现在认为主要是毒素的HN结构域的作用，尽管毒素轻链也参与了此过程。在BontA的HN结构域中存在与大肠杆菌素、白喉毒素等其他膜转运毒素相似的序列元件，这种序列元件被认为与离子通道的形成及轻链跨膜转运相关。虽然最初预测形成穿膜。α-螺旋结构的重链第659～681位肽段（GAVILLEFIPEIAIPVLGTFALV），在中性环境的晶体衍射结果中是以β-片层结构存在的，但是，随后合成相应肽段进行的研究证明，这种基序确实能够在离体环境中形成离子通道。根据实验中的构象能量结果计算，形成通道需要4个这样的螺旋相互作用。Bont在磷脂双分子层上形成通道的晶体结构，也说