基于温敏型材料固定化酶制备及其在蛋白质组快速探析中应用.docVIP

基于温敏型材料固定化酶制备及其在蛋白质组快速探析中应用 　　摘要 蛋白质组学通过规模化鉴定、分析从细胞、组织或有机体中提取的蛋白质，从而获得蛋白表达、修饰、组成和定量的变化信息。在目前最为有效的“鸟枪法”蛋白质组学策略中，固定化酶试剂基质常用固相载体材料，该固定化酶试剂在酶解蛋白质时为异相体系，存在固液界面传质阻力和空间位阻，限制了酶解效率和样品处理通量。针对这一技术瓶颈，本研究利用温敏聚合物对外界温度变化的响应能力，制备了一种新型的基于可溶性温敏聚合物的固定化胰蛋白酶试剂。该固定化酶特有的温度敏感特性，使其具有“高温均相酶解，低温异相分离”的特色，且兼具酶切时间显著缩短、酶可重复利用的优势。BSA1min固定化酶解产物肽段的氨基酸序列覆盖率可达94%，高于传统溶液酶解12h所得覆盖率为（74%）。进一步将该固定化酶试剂应用于HeLa细胞全蛋白质组的酶解，其酶解效果与相同条件下溶液酶解12h相当。该固定化酶试剂对复杂蛋白质的快速、高效酶解充分证明其在蛋白质组学研究中的应用潜力 关键词固定化酶；温度敏感型聚合物；质谱鉴定；蛋白质组学；快速酶解 1引言 蛋白质组学通过对从细胞、组织或有机体中提取的蛋白质进行规模化分析鉴定，系统性的获得蛋白表达、修饰、组成和定量的变化信息[1，2＼]，已成为生物学和医学研究中的热点领域。目前，蛋白质组学中应用最为广泛的研究策略是基于质谱的“鸟枪法”策略，该策略利用蛋白酶将蛋白样品酶解为肽段混合物，然后通过液相色谱质谱联用（LCMS）分析鉴定肽段样品，最后将所得质谱数据在数据库中搜库检索，从而获得相应蛋白质的详细信息[3，4＼]。在这一策略中，蛋白质的定性、定量信息都是通过对其酶解肽段产物进行分析鉴定得到的，因此，蛋白质的酶解成为该研究策略中至关重要的一步。在“鸟枪法”策略中，目前广泛使用的溶液酶解方法所需时间过长（12～24h），严重限制了样品的处理速度和通量。而且溶液酶解中的蛋白酶只能单次使用，无法回收，导致使用成本较高。固定化蛋白酶试剂可避免蛋白酶自身酶解效应，并且显著提高了酶与底物的投料比，缩短了反应时间，提高了酶解效率；另外，固定化蛋白酶可回收重复使用，大大降低了蛋白酶的使用成本[5～7＼]。目前已报道了多种不同的蛋白酶固定化方法及固定化载体材料，如介孔材料[8，9＼]、毛细管石英柱[10，11＼]、芯片材料[12，13＼]、二氧化硅材料[14，15＼]或磁性纳米颗粒[16，17＼]。但是，目前所使用的固定化载体多为固相材料，固定化蛋白酶与溶液中的蛋白质底物在异相体系中进行酶解反应，固液界面的传质阻力和固相材料的空间位阻限制了固定化酶与底物的碰撞和酶解效率的进一步提高 针对上述技术瓶颈，本研究提出并发展了基于温敏聚合物载体的固定化蛋白酶，利用温敏聚合物的温度敏感特性，通过控制温敏聚合物固定化蛋白酶所处环境温度使其在溶解和不溶解间相互转换，从而在溶液中呈现不同状态，以达到“均相酶解，异相分离”的目的。温度敏感型聚合物水溶液通常具有相转变温度，其中一类为最高临界溶解温度（UCST）型，当环境温度高于其相转变温度时，聚合物在水溶液中呈完全溶解状态；当环境温度达到或低于该聚合物的相转变温度时，聚合物开始聚集，析出沉淀[18，19＼]。本研究以N丙烯酰甘氨酰胺（NAGA）为温度响应基团，合成了具有UCST温度响应能力的N丙烯酰甘氨酰胺共聚十一烯醛（poly（NAGAcoUnAl））温敏聚合物，将该温敏聚合物作为载体材料，制备得到新型可溶性温敏固定化胰蛋白酶。通过控制反应体系温度使固定化酶对蛋白质样本实现了“高温均相酶解，低温异相分离”，消除了固定化蛋白酶酶解时的固液界面传质阻力和空间位阻，大大缩短了酶解时间，提高了酶解效率。常用的固定化酶方法大多用固相载体制备，酶解均在异相体系反应；相较于此，本研究制备的固定化酶试剂，在37℃超声溶解，与蛋白进行均相反应，置于冰水浴中，固定化酶试剂团聚沉淀，与酶解肽段分离，达到异相分离，酶解效率提高，酶解效果比固相载体高。此固定化蛋白酶试剂在标准蛋白和复杂样本中均取得良好效果，证明其在蛋白质组学研究中的应用潜力 2实验部分 2.1仪器与试剂 基质辅助激光解析飞行时间质谱（NewultrafleXtremeMALDITOF/TOFMS），EQUINOX55型傅里叶红外光谱仪（FTIR）均购自德国Bruker公司；四极杆静电场轨道阱组合高分辨串联质谱仪（QExactivePlusOrbitrapMS），液相色谱（EasynLC1000），均购自美国ThermoFisherScientific公司 牛血清白蛋白（BSA，98%）、胰蛋白酶（90%）、甘氨酰胺?}酸盐（98%）、丙烯酰氯（98%）、10十一烯醛（UnAl，95%）、氰基