酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究.pdf

酵母表达鲣鱼降钙索基因载体的构建及相关研究 配体蛋白AGA2亚基。AGA2亚基与酵母表面的AGAl亚基通过二硫键连接于酵母 表面的葡聚糖上，从而实现了外源蛋白在酵母表面的表达。质粒p—sct—sf通过LiAc 照验证重组鲑鱼降钙素的活性。利用间接荧光标记的方法，在荧光显微镜下观察到 转化子中有52％的细胞表达外源蛋白．在肠激酶的作用下，转基因酵母中的外源蛋 白释放到酶切液的上清当中．该上清简称为EKS． 外源表达的蛋白通过细胞实验对其体外的活性进行了检测。实验中采用的是破 骨细胞。破骨细胞作为一种终分化细胞，能够在骨组织上进行骨的吸收，形成骨陷 窝。实验首先通过骨片切割机制作了小牛皮质骨骨片。骨片与破骨细胞进行培养的 过程中加入了yAGA2一V5 液)作为培养实验的阳性对照。骨片培养一周之后，骨片在数码显微镜下拍照并计 EKS能够显著减少骨陷窝的生成。即重组 算出骨陷窝面积。结果发现yAGA2-sCT 鲑鱼降钙素能够在体外掷铷破骨细胞的活性。 根据英国药典的方法进行了动物降血钙实验。动物采用了正常的Wistar雌性大 鼠。实验分为阴性对照组，阳性对照组和试剂组。阴性对照组灌胃59／kgyAGA2-V5， 阳性对照组则注射200mlU／kg密钙息(医用鲑鱼降钙素注射液)。试剂组当中，灌胃 了低、中、高三个剂量(O．1 g／kg，0．5g／kg,5g／kg)冷冻干燥的yAGA2-sCT。实验动 物在不同的时间段(1，2，4，6，8，10小时)从眼球丛静脉毛细血管吸取全血制 备血清，血清送往青岛市解放军401医院测定血钙值。实验结果表明，灌胃5班g 嚣姆表达鲑鱼降钙囊基因载体的构建及相关研究 能持续降低血钙值，且呈现出剂量效应。转基因酵母yAGA2-sCT的持续降血钙能力 对治疗高钙血症具有特殊意义。 高钙血症是最常见的伴癌内分泌综合征，晚期癌肿病人约10％有高钙血症。当 此症状转化为i酾血危象时，将严重威胁患者的生命。目前治疗高钙血症的首选药 物是pamidronate等双磷酸盐药物。这些双磷酸盐药物毒副作用较大，长期使用可能 导致体内解毒器官病变。鲑鱼降钙素安全性强且见能迅速降低血钙值，但注射鲑鱼 降钙素2小时之后药效逐渐消失，故临床上鲑鱼降钙素在治疗高钙血症时作为辅助 药物。 为了研究转基因酵母yAOA2-sCT对高钙血症的作用，实验首先制作了高钙血症 大鼠模型。根据文献方法，连续一周灌胃正常的Wistar雌性大鼠活性维他命D3(1， mM上升到2．838_+0．022 25一di}lydroxy—eholecalcifer01)。大鼠血钙值由2．638_+0．017 mM，显著高于普通大鼠，标志着造模的成功。高钙血大鼠实验分为阴性对照组，阳 性对照组和试剂组。阴性对照组灌胃5ggyAGA2-V5，阳性对照组则注射1．25 毛细血管吸取全血制备血清，血清送往青岛市解放军401医院测定血钙值。实验发 现，灌胃5鲫喑冷冻干燥的酵母yAOA2一sCT显著降低了模型大鼠的血钙值，血钙值 从2．81±O．018m／Vl降低到了2．69±0．025 mM，差异显著，PO．01。灌胃O．59，蚝 6 yAGA2-sCT时，血钙值降低到2．75±0．01raM，PO．05。实验表明转基因酵母对 高钙血症具有抑制作用。 酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相莱研究 实验探讨了转基因酵母的yAGA2一sCT的生物安全性问题。在急性毒性实验中· 未能检测出半致死剂量LD50。在亚急性毒性实验当中，检测了大鼠的体重变化，血 液生理指标，生化指标，脏器系。各项指标均无显著变化，初步证明转基因酵母用 药安全。论文探讨了鲑鱼降钙素的口服给药可能的新途径，拓宽了鲑鱼降钙素在高 钙血症治疗上的应用。为鲑鱼降钙素在我国医疗事业上更广泛的使用提供了实验依 据． 关键词：鲑鱼降钙素；破骨细胞；酿酒酵母； 高钙血症； 酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究 i