5免疫荧光技术(修改后) 2.ppt

免疫标记技术; 用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。;免疫标记技术 =;常 用 标 记 物 荧光素 酶 同位素 胶体金 可发光化学物质;试验命名： 根据标记物命名 如：免疫荧光技术 免疫酶技术等;免疫标记技术;免疫荧光技术 （ Immunological fluorescent technique，IF);原理： 用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原。;免疫荧光技术分类： 免疫荧光显微技术（定性） 免疫荧光测定技术（定量）;一.荧光、荧光素及荧光显微镜;（一）荧光 一种光照射某种物质时，该 物质可发出比照射光波长更长的 光称为荧光。 照射光:可见光、紫外光;(二）荧光素 能产生荧光的物质，可作为染料。 ;常用荧光素： 1.异硫氰酸荧光黄(FITC) 可发出黄绿色荧光;2.四乙基罗丹明（RB200) 发出橘红色荧光;3.藻红蛋白（PE） 发出橙色荧光;（三）荧光显微镜 1.结构：主要组成 A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰 紫光； B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野，只允许荧光通过。 C.显微镜：普通的光学显微镜。 ; 光路程序： 白炽光源 —— 发射紫外光or兰紫光 —— 激发滤板 ——紫外光 ——被检物（荧光染色标本）——紫外光＋荧光 —— 抑制滤板——荧光（显微镜下可见） ;目镜;荧光显微镜据光源路径分 透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品，适用于观察对光可透的标本） 落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）;2.使用注意事项： 染色后立即检查（荧光易猝灭） 准备好后开启白炽光源，不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭 每次使用2小时 保持室内通风; 荧光素可以标记（染色）抗原，也可以标记抗体 标记抗原 用得?? 标记抗体 用得多 一般免疫荧光显微技术均标记抗体;二.免疫荧光显微技术 （一）荧光抗体的制备 （二）片子的制作 （三）荧光抗体染色方法;（一）荧光抗体的制备： 纯化的一定量抗体 加一定量 FITC(搅拌使结合） 去除游离荧 光素 测抗体效价、测荧光素 与蛋白质（Ab）结合比（F/P） 小量分装保存备用;（二）片子的制作： 1.常做切片、涂片、印片，要求薄、均匀，并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。 2.注意保持抗原完整性 3.不同材料固定方法不同（无水已醇、丙醇、聚甲醛等）;（三）荧光抗体染色法; 1.直接法 待测标本固定（Ag？） + Ab ;;2.间接法 分两步： 第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光 标记的羊抗人IgG）； 第二步：已知Ag固定＋待测标本（Ab？）——洗涤，＋荧光标记的 抗抗体——洗涤，荧光显微镜镜检 ;间接法用得最多 优点： 制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测 灵敏度高 ;3.补体法： 第一步：荧光素标记抗补体； 第二步：已知Ag固定＋待测标本（Ab？）＋补体——洗涤，＋荧光标记的抗补体——洗涤，荧光显微镜镜检;特点： 灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多 种检测 干扰因素多，补体不稳定，易失活， 该法少用;4.双标记法 用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。;（四）免疫荧光显微技术优缺点 优点： 1.特异性、敏感性高 2.快速 3.可定位 4.既可测Ag又可测Ab;缺点： 1.需要荧光显微镜 2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题） 3.定性测定、判断结果不客观 4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）;三.时间分辨荧光免疫测定 （液相检测） 原理： 用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag ，从而检测待测标本中相应Ag或Ab的新技术。 其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特