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中心蛋白C端半分子及其磷酸化性质的研究 【摘要】：中心蛋白(centrin)是一种分子量大约为20kDa的中心体常驻蛋白,它与细胞内纤维收缩、细胞分裂及纺锤体的分离等密切相关。在细胞内,蛋白质可逆磷酸化是一种重要的共价翻译后修饰(PTMs),为生物体内的信号转导和细胞调节起到重要作用。因此其在机体内的磷酸化与去磷酸化行为,为细胞内外信号转导提供了一个重要的调控机制。每个中心蛋白分子均含有四个结构域,每一个结构域可以结合一个金属离子,其中、结合位点位于蛋白的N端结构域；、结合位点位于蛋白的C-端结构域。本文选用中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)为研究对象,着重研究了由蛋白激酶A介导的C-EoCen磷酸化前后同金属离子之间的相互作用以及化学交联的性质。首先运用分子生物学方法,构建得到了一个基因重组质粒pGEX-6p-C-EoCen,将重组质粒pGEX-6p-C-EoCen转入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得表达工程菌并挑取单菌落活化、培养诱导,离心收集菌体,超声裂解液经GST柱亲和层析、PPase酶切、浓缩处理后获得中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)。经SDS分析显示所得蛋白不含有杂蛋白条带,达到实验所需纯度。运用荧光光谱、圆二色光谱和紫外差光谱的方法研究C-EoCen与Sm3+的结合。发现Sm3+与C-EoCen结合后,蛋白质从关闭式构象转换为开放式构象,蛋白的疏水性结构域外露程度增强；蛋白质的α-螺旋含量明显增强；Sm3+与C-EoCen的、结合位点的条件稳定常数分别为：1gK=6.814≈0.51,1gKⅢ=6.23+0.39。Native、TNS荧光实验表明PKA可以催化C-EoCen发生磷酸化反应；磷酸化修饰后的C-EoCen暴露的疏水面积比磷酸化前的蛋白减少,并发现金属离子Ca2+、Tb3+、Gd3+对C-EoCen的磷酸化均有抑制作用,随着金属离子的增加抑制作用更为明显。利用Native、TNS荧光实验表明,磷酸化前后的中心蛋白C-端半分子加入化学交联剂戊二醛后,蛋白分子均显示出多聚体条带；当蛋白同金属离子Tb3+Gd3+作用后,交联更为明显；交联后的C-EoCen暴露的疏水面积比交联前的小,但是交联后的磷酸化C-EoCen比交联前暴露的疏水面积大。【关键词】：中心蛋白C-端半分子磷酸化蛋白交联光谱化学交联 【学位授予单位】：山西大学 【学位级别】：硕士 【学位授予年份】：2013 【分类号】：Q51 【目录】：缩略语12-14摘要14-15ABSTRACT15-17第一章综述17-311.1引言17-221.1.1中心蛋白的结构17-201.1.2中心蛋白的功能20-221.2中心蛋白的磷酸化22-281.2.1蛋白质磷酸化概述22-231.2.2蛋白磷酸化后的信号网络23-241.2.3蛋白质磷酸化位点24-251.2.4蛋白激酶以及催化机理25-281.3中心蛋白聚集性质的研究28-291.4本课题研究的意义29-31第二章中心蛋白的构建、表达及纯化31-412.1引言312.2实验材料31-342.2.1菌种和质粒312.2.2寡核苷酸31-322.2.3主要酶和生化试剂322.2.4主要试剂的配制32-342.3实验方法34-372.3.1重组质粒的构建34-362.3.2中心蛋白的表达和纯化36-372.4实验结果37-392.4.1重组质粒的构建37-382.4.2中心蛋白C-端半分子的诱导表达和纯化鉴定38-392.5结论39-41第三章中心蛋白C-端半分子同金属离子的作用研究41-493.1引言413.2实验材料41-423.2.1主要试剂413.2.2实验仪器41-423.3实验方法423.3.1Sm~(3+)溶液的制备423.3.2TNS溶液的制备423.4光谱测定423.5结果与讨论42-473.5.1Sm~(3+)对C-EoCen构象的影响42-443.5.2Sm~(3+)与C-EoCen的结合常数44-473.6结论47-49第四章中心蛋白C-端半分子的磷酸化49-594.1引言494.2实验材料49-504.2.1实验试剂49-504.2.2实验仪器504.3实验方法50-524.3.1Mg~(2+)溶液(33mM100mL)的配制504.3.2Ca~(2+)溶液(0.144M,100mL)的配制504.3.3Tb~(3+)溶液的配制50-514.3.4Tris-Hcl(50mM,100mL)514.3.5ATP溶液配制(100mM,100mL)514.3.6中心蛋白脱钙方法514.3.7中心蛋白浓度测定方法514.3.8中心蛋白磷酸化的方法514.3.9金属离子对中心蛋白的磷酸化实验方法514.3.10SDS和Native(聚丙烯酸胺凝胶电泳)分析514.3.1115%天然胶