DNA第2代测序技术_免费下载.pptVIP

DNA第2代测序技术与遗传学发展 一. DNA第2代测序技术 二. 遗传学的发展 三.第2代测序技术对遗传学发展的影响 1.1 什么是DNA第2代测序技术 第2代测序技术（next-generation sequencing）是对传统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 一. DNA第2代测序技术 1.2 为什么要发展第2代测序技术 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。 1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。 1.3 第2代测序技术的特点 速度快 准确度高 成本低 覆盖度深 产出巨大 1.4 第2代测序技术的原理 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介绍。 图1. 454测序技术流程 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物(homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。 图2. Solexa测序技术流程 Solexa技术的读取长度可以达到2×75bp，相比454技术，其后续的序列拼接工作的计算量和难度均大大增加。 Solexa技术主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插入或缺失，目前它的错误率大约在1-1.5 %之间。 Solexa技术每个循环能获得20.5-25 Gb的测序结果，耗时约9.5天。 Solexa技术在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好地解决了同聚物长度的准确测量问题。 图3. SOLiD测序技术流程 SOLiD技术与Solexa技术类似，后续的序列拼接工作也比较复杂。 SOLiD技术每个循环的数据产出量为10-15 Gb，耗时约为6-7天。 SOLiD技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达2×50bp，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能达到99.94 %以上。 1.5 第2代测序技术的应用 高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence) 。 2007年Van Orsouw等人结合改进的AFLP 技术和454 测序技术对玉米基因组进行了重测序，所发现的超过75%的SNP位点能够用SNPWave技术验证，提供了一条对复杂基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线。 2008年Hillier对线虫CB4858 品系进行Solexa重测序，寻找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3’端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。而这些信息无论使用芯片技术还是SAGE文库测序都是无法被发现的。 高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。 高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验