RNA提取中各种试剂的作用.docVIP

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。RNA提取过程，有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相。氯仿的作用有多个方面，加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。一般的trizol试剂在4度下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相。离心后混合物分成三层：下层苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为400ul。【标准：1mlTrizol加200ul的氯仿，水样层的容量大约为所加Trizol 容量的60% 】上层水相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，RNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，RNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈震荡才行，这样才能彻底地两相混匀。异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA， RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样