免疫标记技术应用课件.pptVIP

MTT（噻唑蓝）比色法 原理： 活细胞线粒体中的琥伯酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜并沉积在细胞中，死亡细胞无此功能。二甲基亚枫（DMSO)能溶解细胞中的甲臜。490nm吸收峰。 应用： 生物活性因子的活性检测 抗肿瘤药物筛选 细胞毒性检测 肿瘤放射敏感性测定 特点： 敏感度高，重复性好，操作简便，经济，快速，易自动化，无放射性污染 同位素标记寡核苷酸探针杂交 细胞和组织的原位杂交 原位杂交和组化双染和多染 基 因 标 记 GFP（Green Fluorescent Protein 绿色荧光蛋白） LacZ（ β-galactosyltransferase β-半乳糖苷酶） CAT ( Chloramphenicol acetyltransferase 氯霉素乙酰转移酶） GFP的性质 1962年在水母中发现，1992由Prasher克隆 有238个氨基酸组成，分子量为27KD 野生型GFP被紫外蓝光激发后，能发出绿色荧光 不需要底物或辅助因子，可对活体检测、体积小、表达无种属限制、荧光表达稳定、有多种突变体、检测方便、无放大作用 GFP基因转染方式 磷酸钙法 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导的转染 电穿孔转染法 基因枪粒子轰击法 受体介导的基因导入法 GFP标记的神经元 GFP 应 用 细胞发育分化研究 标记基因 筛选阳性胚胎 荧光动物模型 细胞移植示踪 LacZ （β-半乳糖苷酶） 原 理 LacZ （β-半乳糖苷酶）可将X-gal（5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）转变为不溶性的深蓝色沉淀 PITX2-LACZ Staining of mouse embryo day 11 溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,BrdU) 溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,BrdU) BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争参入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶 溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)特点 简单、快速、安全、检测的敏感性好 在免疫细胞化学技术中，可产生一种对比度高的标记，适合于大块组织的快速检查，尤适于定量研究 即可适于活体标记，亦可以用于细胞或组织细胞增殖、分化的标记 对活体动物无任何副作用 BrdU标记的组 化和荧光照片 荧光染料标记 核标记 膜标记 核 标 记4，6-联脒-2-苯基吲哚（4‘,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride ，DAPI) DAPI荧光染料 是由Dann等人于1971年合成的，共化学名称为的中文名称4，6-联脒-2-苯基吲哚，分子量为350．它是二价阳离于的荧光染料，一种黄色晶体易溶于水，最大溶解度为2．5％．它具有专一性强、灵敏度高、稳定性好等特点。 DAPI不足： 1、DAPI除与DNA双链结合外，还可与细胞浆中的微管蛋白结合，故胞浆也着蓝色。 2 、 DAPI标记细胞的很大不足就是当标记细胞死亡后，就可以释放出DAPI，将周围未标记的细胞标记，产生假阳性，这是我们用这类荧光染料标记细胞时必须考虑的问题。 DAPI标记大鼠骨髓基质干细胞 DAPI标记神经细胞 膜 标 记 PKH26/PKH67 PKH荧光细胞标记试剂细胞膜标记技术，在细胞膜的脂质双分子层中稳定结合红色荧光染料－PKH26/绿色荧光染料－PKH67，产生稳定、清晰、精确和可重复的荧光标记细胞，可广泛用于动物、植物细胞和其它含颗粒胞膜的标记。Advantage： 1． 标记的细胞种类广，无明显细胞毒性； 2． 既满足染料最大溶解性和染色效率，又保存细胞活力; 3． 适用于体外细胞增殖试验； 4． 适合体内、体外细胞迁移研究 A B C 5 week 6 week 7 week 免 疫 磁 珠 技 术 标 记 技 术 的 应 用 一、目的和意义 二、标记技术的种类 酶学标记 荧光标记 同位素标记 基因标记 BrdU标记 荧光染料标记 免疫磁珠 MTT比色法 酶学标记的种类、原理与应用 免疫组织化学实验 酶联免疫吸附实验（ELISA） 酶联免疫斑点实验（ELISPOT） 原位杂交酶学组织化学 免 疫 组 化 组织片的免疫组化染色 细胞培养片组化 免疫组织化学分类 细胞培养片: 组 织 切 片：石蜡切片 冷冻切片 注意事项