细胞周期调控幻灯片.pptVIP

细胞周期调控 生物工程学院 王丹 ⅠMPF的发现及其作用: MPF,即卵细胞促成熟因子(maturation-promoting factor),或细胞促分裂因子(mitosis-promoting factor),或M期促进因子(M phase-promoting factor). 背景一: Rao和Johnson(1970、1972、1974)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞在灭活仙台病毒介导下诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的染色体凝集,称之为染色体超前凝集(prematurely condensed chromosome，PCC)。如图所示: G1期PCC为单线状，S期PCC为粉末状，G2期PCC为双线染色体，因DNA未复制;因DNA由多个部位开始复制;说明DNA复制已完成。 人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，称为细胞促分裂因子。 不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生: 背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出了MPF这一概念。非洲爪蟾卵细胞发育过程分为六个阶段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期。前四个时期为卵母细胞生成和生长阶段 。其中 第Ⅳ期时细胞核较大，称为生发泡(germinal vesicle,GV),此时细胞就停留在该时期，等待成熟。 因此，在成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟，称之为促成熟因子，MPF。进一步实验表明：在成熟卵母细胞中，MPF已经存在，只是处于非活性状态，称为前体MPF(preMPF)。非活性态的前体MPF通过翻译后修饰，可以转化为活性态的MPF。 分离纯化出MPF： 直到1988年，Maller实验室的Lohka等人才以非洲爪蟾为材料，分离得到了微克级的纯化的MPF。证明其含有p32和p45两种蛋白。二者结合后表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。证明，MPF是一种蛋白激酶。 Ⅱ p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系： 另一批生物学家以酵母为材料,从另一个侧面对细胞周期调控进行着深入研究.如:L.Hartwell以芽殖酵母为实验材料, P.Nurse以裂殖酵母为实验材料。 他们的实验原理都相同：均是在不同温度下培养酵母,获得不同的温度敏感突变体, 这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段以及表现出不同的形态结构。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为 (cell division cycle) cdc基因，根据被发现的先后顺序被命名。 P.Nurse在裂殖酵母中发现的cdc2基因就是第一个被分离出来的cdc基因。其表达产物是一种相对分子量为34×103的蛋白，被称为p34cdc2,进一步研究发现， p34cdc2具有激酶活性，可使多种蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周期调控中起关键性调节作用。 L.Hartwell在芽殖酵母中发现的cdc28基因是第二个被分离出的cdc基因，其表达产物也是一种相对分子量为34×103的蛋白，被称为p34cdc28，它也是一种蛋白激酶，在G2/M转换过程中起中心调节作用。 由此得出p34cdc2与p34cdc28是同源物。进一步研究发现：二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如： p34cdc2必须与另一种蛋白p56cdc13结合后才具有激酶活性。 很快Maller＋Nurse证明：MPF中的p32可以被p34cdc2特异抗体所识别，并且p34cdc2多肽片断可以加速MPF活性，表明二者是同源物。 Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。 芽殖酵母及其细胞周期 裂殖酵母及其细胞周期 在研究酵母的同时，以Tim Hunt为代表的另一批科学家正在以海胆卵为材料，对细胞周期调控进行着深入研究。他们发现：有两种蛋白质的含量随细胞周期进程的变化而变化，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个周期中又重复这一消长现象。因此称这两种蛋白为细胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。 Maller＋Hunt合作证明：MPF中的另一种成分是周期蛋白B。序列分析证明，周期蛋白B与酵母的p56cdc13是同源物。 由此MPF的生化成分得到确定： MPF = p34cdc2 + cyclinB （催化亚单位） （调节亚单位） 2001年10月8日美国人Leland?Hartwell、