关节软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的实验研究论文.docVIP

　　关节软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的实验研究论文 .freelental Study on Chondrocyte Apoptosis Folloission election microscopy(TEM)，fluorescenceactivated cell sorter(FACS) oral condyles obtained at different intervals folloens displayed statistically significant increased overall level of apoptosis，most of apoptotic chondrocytes iddle zone.Conclusion Chondrocyte apoptosis may contribute to the subsequent development of posttraumatic arthritis.It portant to prevent the knee from posttraumatic arthritis by repressing chondrocyte apoptosis as early as possible. Key med cell death，PCD)，特点是胞体缩小、DNA片断、出现凋亡小体以及炎症反应。细胞凋亡发生在对机械和热损伤、毒素、细胞因子、病毒和细菌等因素的应答中［1］。Kim等［2］的研究表明，软骨细胞的凋亡可能会导致创伤后骨关节炎的发生。软骨损伤后的病理改变及其引起创伤性关节炎发生的机制还不清楚，本实验通过对兔膝关节急性损伤模型的观察，探讨软骨急性损伤后细胞死亡的方式以及与骨关节炎发生之间的关系。 1 材料与方法 1.1 动物模型的制作 选用新西兰大白兔，重2.5～3.0 kg。2％戊巴比妥钠静脉麻醉，双侧膝关节局部剪毛。参照Costouros等［3］介绍的方法，用2.0 mm直径的钻头钻孔造模。兔取仰卧位，四肢固定，膝关节屈曲。常规碘伏消毒，髌韧带内侧切口，过屈膝关节显露股骨内外髁承重面，用直径2.0 mm的钻头在股骨内外髁承重面钻孔，钻透全部软骨直至软骨下骨，深度2～3 mm，造成膝关节软骨机械性损伤。钻孔后，冲洗关节腔后逐层缝合，苏醒后分笼饲养，自由活动。 1.2 动物分组 选用新西兰大白兔28只，体重2.5～3.0 kg。随机选择一侧膝关节造模，对侧作为对照。选择术后第0、2、4、7、10、14天和4周为观察时间点，并据此随机分为7组，即0 d(4只)、2 d(4只)、4 d(4只)、7 d(4只)、10 d(4只)、14 d(4只)、4周(4只)。另外再取新西兰大白兔20只，16只双侧膝关节钻孔造模致软骨损伤，作为损伤组，4只作为正常组(兔膝关节软骨细胞本身数目较少，一个损伤部位分离的细胞数不能满足流式细胞仪检测的要求。因此实验中双侧同样标准造模，将每只兔两侧股骨内外髁受损区分离的软骨细胞合在一起进行流式细胞计数检测)，用于流式细胞仪检测。 1.3 标本的采取 术后各时间点空气栓塞处死动物快速采取标本。切取股骨内外髁钻孔区周围直径为3～4 mm全层软骨。各时间点标本经石蜡包埋切片，用于脱氧核糖核苷酸末端转酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(terminal deoxynucleotide transferasemediated deoxyuridinebiotin nick end labeling，TUNEL)观察。第4天的标本同时切取小部分用于电镜观察。用于流式细胞仪检测的兔于术后第2、4、14天和4周空气栓塞处死(每点4只兔)，无菌操作下切取受损的软骨，宽约2～3 mm，置于离心管中，磷酸盐缓冲液冲洗，2 000 γ/min离心10 min去除上清液，0.25％的胰蛋白酶消化30 min，2 000 γ/min离心10 min去除上清液，0.2％Ⅱ型胶原酶，在37℃恒温培养箱内消化，每隔1 h吹打1次，4～6 h软骨碎片完全溶解，再经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液( 大于 1×106/mL )，用于流式细胞计数检测。 1.4 透射电镜观察软骨细胞超微结构变化 取术后第4天的受损软骨及对照侧正常软骨标本各2份。放入2％的戊二醛磷酸缓冲液中，置4℃冰箱48 h作前固定，将标本修整成宽约为1.0 mm的长条形，磷酸盐缓冲液漂洗后，再在1％的锇酸中后固定2 h。按常规漂洗、脱水、渗透，环氧树脂包埋，ULTRACUTE超薄切片机(德国REICHERTJUNG)超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双染色，JEM1200透射电镜(日本)观察、摄片(加速电压60kV)。 1.5 流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率 将分离的软骨细