内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法论文.docVIP

　　内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法论文 .freelembrane）作为载体，将EC和SMC接种于微孔膜的两侧，建立EC和SMC联合培养模型，模拟血管壁EC和SMC间的结构关系，采用倒置显微镜和透射电镜进行观察. 结果 共培养的EC和SMC组织结构关系类似于体内，EC呈单层生长，而SMC呈多层生长.freelooth muscle cells;cell culture;gap junction Abstract:AIM To develop a method of endothelial and smooth muscle cells co-culture by ooth muscle cells icroporous polycarbonate filters.The interactions betined by inverted microscopy and transmission electron microscopy.RESULTS Status of the co-cultured cells ilar to that in vivo.Relative to the endothelial cells monolayer，the smooth mus-cle cells ultilayer.There any gap-junctions a-mong the endothelial cells and smooth muscle cells respec-tively.The heterocellular gap-junctions also existed betber of the myoendothelial junctions had respect to the co-culturing time.After SMCs ed the gap junctions through the micropores ethod might be a promising in vitro model for studies of interactions betooth muscle cells. 0 引言 血管内皮细胞（endothelial cell，EC）和平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）之间的信号转导可以通过两种方式进行:①通过细胞间的体液性信息联系;②通过细胞间缝隙连接的接触性信息联系.前者涉及到一系列的细胞因子，由EC释放，而SMC上面有相应的受体［1］ ，如:内皮依赖性舒张因子（EDRF）.在缝隙连接中，同类或异类细胞之间通过缝隙可进行离子和代谢产物的传递等.血管EC和SMC间的缝隙连接具有方向性和电荷选择性，缝隙连接的多寡在血管的不同节段和不同的器官组织是不同的［2，3］ .这两种细胞的体液性及接触介导性信息联系对维持血管壁自身稳定有重要意义，这种信息联系的失衡可能与SMC的增生、动脉粥样硬化的发生有直接的联系［4］ .目前比较好地模仿生物体内EC和SMC关系的培养模型有微载体技术以及灌注跨毛细血管平滑肌内皮细胞共培养模型［5，6］ ，能够模仿体内的血流动力学环境，但其技术要求高，一般实验室不易实现. 我们采用了微孔聚碳酸酯膜作为EC和SMC共培养的载体，该模型可以模仿体内EC和SMC的组织结构关系，在此基础上，利用倒置显微镜和透射电镜观察了两种细胞的生长情况和细胞间缝隙连接情况，为下一步研究两者间的电生理活动提供了保障. 1 材料和方法 1.1 材料 牛主动脉取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠（第四军医大学实验动物中心）;1640培养基（Gibco）;加强小牛血清（Hyclone）;聚碳酸酯膜（10mm×15mm，厚12μm，孔径5μm，孔密度2800 mm-2 ，Millipore公司）;2g L-1 明胶（Gibco）. 1.2 方法 1.2.1 牛主动脉EC（BAEC）和仔鼠SMC的分离和鉴定 按我们已建立的方法培养并鉴定牛主动脉EC和仔鼠胸主动脉SMC［7］ ，利用2～5代细胞进行实验. 1.2.2 EC和SMC的共培养 ①聚碳酸酯膜的准备:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min高压消毒后备用，用前用明胶包被，培养箱内孵育3h，PBS浸洗后接种细胞;②共培养:按密度1×104 cm-2 将内皮细胞接种于聚碳酸酯膜的一侧，常规培养24h后翻转聚碳酸酯膜，将平滑肌细胞接种于膜的另一侧，24h后换液，以后每日换液1次，常规倒置显微镜观察，取接种后1，3和4d共培养标本进行透射电镜观察. 1.2.3 透射电镜（TEM）标本的准备［8，9］ 取出两侧长有细胞的聚碳酸酯膜，用预热的PBS漂洗，