免疫磁珠分离技术.docVIP

磁珠分离技术 一、原理 免疫磁珠法分离细胞基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合，在外磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠法分正选法和负选法，也称阳性分选法和阴性分选法。正选法-磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞；负选法-磁珠结合的细胞为不需要细胞。一般负选法分选较为常见，因为此方法获得的所需要的细胞表面不含有抗体及磁珠的干扰。现以两步法分选小鼠CD4+ CD25+ T细胞的分选为例分别介绍负选法、正选法如下。 1、材料试剂： 1、生物素化的，小鼠CD4阴性分选抗体混合物[cocktail，内含抗B细胞（CD45R，B220）、CD8+T细胞（CD8a，Ly-2）、造血细胞（CD11b,Mac-1），NK细胞（CD49b,DX5）等非CD4+T细胞表面标志的抗体]。 2、结合有磁珠的抗生物素抗体（Scimall科学在线提供）；含0.5%BSA（或0.5%FCS）及2mmol/L EDTA的PBS缓冲液；抗小鼠CD25-PE抗体；结合有磁珠的抗PE抗体（Scimall科学在线提供）；磁珠分离器或分离柱。 2、实验步骤 1、负性分选小鼠CD4+T细胞 2、阳性分选小鼠CD25+ T细胞 二、注意事项： 1、如果分离细胞用作培养，全过程注意无菌操作。 2、磁珠分离系统分离的细胞 纯度可以达到80%-99%，得率在60%-90%左右，仅次于或相当于流式细胞仪的分选效率，与FACS相比，MACS设备简单，耗时极短，故而应用广泛。设定不同的程序（细胞得率或纯度不可兼得），连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达到95%-95%。 3、由于阳性分选得到的细胞表面结合有抗体及磁珠，有可能影响细胞的功能，故目前常用阴性分选的方法分离细胞。如果只能用阳性分离的方法，Scimall科学在线建议在分离后培养1-2天，使结合在细胞表面的抗体脱落。 4、抗体包被磁珠对死细胞、红细胞常有非特异性结合。故而分选前去除死细胞、红细胞（如通过Ficoll分离去除）可以提高分离的效果。 三、阳性分选法和阴性分选法的优缺点比较 优缺点 阳性分选法 阴性分选法 优点 1、只需要一种抗体； 2、分离出的细胞纯度高； 3、对于比例小的细胞群，正选容易得到高纯度。 1、需要的细胞没有被抗体等标记2、对需要的细胞，不需要特异性的细胞标记 缺点 1、需要特异性的靶细胞标记 2、可能引起细胞活化 需要多种抗体标记不需要的细胞 取小鼠脾细胞，制成单细胞悬液 加入生物素化的、不针对CD4的抗小鼠抗体混合物 加入PBS缓冲液及结合有磁珠的抗生物素抗体 用MACS仪器，选择适当的分选程序，取阴性部分，即为CD4+ T细胞 PBS洗涤、重悬 PBS洗涤、重悬 4℃孵育15min 4℃孵育10min PBS缓冲液洗涤两次，重悬 收取上述分选的CD4+Ｔ细胞，制成单细胞悬液 加入PE标记的抗CD25 直接加结合有磁珠的抗PE抗体 用MACS仪器,选择适当的分选程序,收取阳性部分,即为CD25+ CD25+ T细胞 PBS洗涤、重悬 PBS洗涤、重悬 4℃孵育15-20min 4℃孵育15-20min PBS洗涤、重悬