分枝杆菌计数方法的比较研究论文.docVIP

　　分枝杆菌计数方法的比较研究论文 罗泰来，申亮亮，柏银兰，薛莹【关键词】 紫外分光光度计法；湿重法；平板菌落计数法；标准曲线；牡牛分枝杆菌 parative study of Mycobacterium counting methods 【Abstract】 AIM: To build up a fast counting method for Mycobacterium vaccae (M. vaccae). METHODS: . vaccae by UV spectrophotometry, easurement and plate count method, and built up tetry to plate count and the other id etry and al linear correlation bet 105/mL to 108/mL. CONCLUSION: The method is dependable, and can be used for quick counting of M. vaccae. 【Keyetry; easurement; plate count; standard curve; Mycobacterium vaccae 【摘要】 目的： 建立牡牛分枝杆菌的快速检测方法. 方法： 采用紫外分光光度计法、测湿重法、平板菌落计数法测定细菌数，建立紫外分光光度计法、测湿重法对平板菌落计数法的标准曲线. 结果： 建立了紫外分光光度计法和湿重法相对于平板计数法的标准曲线，通过准确度分析表明在细菌含量在每毫升105～108之间时，两标准曲线线性关系良好. 结论： 该方法可用于牡牛分枝杆菌的快速计数. 【关键词】 紫外分光光度计法；湿重法；平板菌落计数法；标准曲线；牡牛分枝杆菌 0引言 结核病目前仍是严重危及全球的公共卫生问题之一. 据世界卫生组织估计［1］，当前全球约有20亿人受结核分枝杆菌感染.freeleter）、电子天平，离心机（eppendorf centrifuge 5415 D）, 牡牛分枝杆菌（由微生物教研室保存）；LB培养基，每200 mL含NaCl 2 g、营养粉2 g、酵母提取物2 g，固体培养基加入琼脂粉3.5 g；7H9培养基（DIFCO）. 1.2方法 1.2.1紫外分光光度计法测吸光度用接种环在从分枝杆菌菌种中取一环菌，接种到5 mL LB培养基中. 置于37℃摇床中振荡培养约24 h，使细菌活化. 测吸光度值，当吸光度值＞0.6时将细菌按1∶100的比例转接到200 mL LB培养基中扩大培养，置于37℃摇床中振荡培养. 每隔3 h在超净工作台中用无菌移液枪从培养基中吸取5 mL菌液，于无菌短中管中，其余菌液放入摇床中继续培养. 用1 mL一次性注射器将短中管中菌液反复吹打，充分重悬，使聚集生长的细菌充分混匀. 取6个5 mL离心管，每管加入去离子水2 mL分别标记1～6待用. 从混匀后的菌液中取1 mL，用离心机离心，11 000 g, 1 min，收集菌体沉淀. 去上清，再次离心，充分除去培养液. 用2 mL去离子水重悬，以去除LB培养基对吸光度值的影响. 按倍比稀释法，将菌液进行稀释，得到6个稀释度. 细菌稀释倍数依次为2-1到2-6. 用去离子水做对照，依次对10个离心管中的菌液测吸光度值. 1.2.2用电子天平称细菌湿重按上述方法将细菌扩大培养. 1 mL一次性注射器将菌液反复吹打，充分重悬，使成团生长的细菌充分混匀. 取12支离心管，分别编号1～12，于电子天平上精确称重，准确记录各管重量. 将离心管分成3组，分别为1～4号、5～8号、9～12号. 第1组每管称量菌液0.5 mL，第2组吸1.0 mL，第3组吸1.5 mL. 离心，11 000 g， 1 min. 去上清，吸干培养基，再次离心，直到较好的去除培养基. 将收集了细菌的离心管于电子天平上准确称重，记录重量. 用第二次重量减去第一次重量所得差值即为湿重. 将各湿重除以各管所吸取菌液体积，即得每毫升菌液的细菌湿重，取平均值，即为每毫升菌液所含细菌湿重. 1.2.3平板菌落计数法测活菌浓度按上述方法将细菌扩大培养. 每隔3 h在超净工作台中用无菌移液枪从培养基中吸取5mL菌液，于无菌短中管中，其余菌液放入摇床中继续培养. 用1 mL一次性注射器将短中管中菌液反复吹打，充分重悬，使成团生长的细菌充分混匀. 按十倍递增稀释至10-3~10-7. 取15块LB平板培养基，分别从每个稀释度的菌液中，取200 μL，用平板涂布法，涂于平板中，标明稀释度，每个稀释度涂3块平板. 37℃培养箱培养72 h后，可见菌落形成，选取菌落数在30~300间的平板进行