利用恒溶氧┐补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组肿瘤导向多肽LTL┐TNF论文.docVIP

　　利用恒溶氧┐补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组肿瘤导向多肽LTL┐TNF论文 .freel 40～50时，目的蛋白的表达最高，可达菌体总蛋白的50%，LTL-TNF的含量达到5.12g L-1 .freelen-tation，tumor necrosis factor;peptides Abstract:AIM High cell density cultivation research on re-binant E.coli to produce rebinant tumor targeting peptide LTL-TNF.METHODS To determine its optimized host cell，culture and induction condition，this research first focused on understanding the groatic fermentor.RESULTS By keeping dissolved oxygen at30%～40%and limiting glucose feeding during fermentation，the rebinant protein LTLTNF production of DH5α/pBV-LTLTNF in5L fermentor reached5.12g L-1 ，about50%of total amount of bacterial proteins， 40～50in around12h.CONCLUSION A short cycle，high expression and stabilized fermentation process of rebinant LTLTNF has been established. 0 引言 针对肿瘤抗原和肿瘤血管的抗肿瘤治疗研究是目前肿瘤治疗研究的热点.人黑色素瘤蛋白多糖（human melanoma proteoglycan，HMP）及其大鼠的同源蛋白NG2分别于1991和1996年被鉴定和克隆［1，2］ ，HMP/NG2主要表达于成年动物的肿瘤细胞和肿瘤血管细胞表面，而不表达于正常组织，HMP/NG2表达增高可促进黑色素瘤的增殖［3］ ，抗NG2抗体在体内和体外均显示出抑制黑色素瘤细胞及肿瘤血管生长的特性［3，4］ ，故HMP/NG2已成为肿瘤治疗的靶向目标.LTL十肽可特异性地结合HMP/NG2抗原，从而阻断HMP/NG2的作用［5］ .为了更好地发挥LTL肽的抗肿瘤作用，我们构建了LTL肽与新型重组人肿瘤坏死因子（nean tumor necrosis factor，nrhTNF）融合蛋白的重组表达载体，并在大肠杆菌中获得了该融合蛋白的表达，为了大量获取LTLTNF，以配合动物实验和临床试验，我们对重组LTLTNF工程菌的生长与表达规律进行了探索，建立了稳定的高密度发酵工艺. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 重组质粒与宿主菌 重组质粒pBV-LTLT-NF由第四军医大学生物技术中心构建和保存，含LTL十肽的核酸编码序列和编码突变型人肿瘤坏死因子α（nrhTNF）的基因序列［6］ ，受PL PR 双重启动子控制，在42℃时能诱导LTLTNF融合蛋白的表达，具有氨苄抗性. 宿主大肠杆菌E.coli JM109［recA1supE44en-dA1hsdR17gyrA94relA1thi△（lac-proAB）F’（t-raD36-prDAB+lacIq lacZ△M15）］，E.coli DH5α［supE44△lacU169（Φ80lacZ△M15）hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1］由第四军医大学生物技术中心保存，E.coli YK537（supE44hsdR hsdM re-cA1phoA8leuB6thi lacy rpsL20galK2ara-14xyl-5mth-1）由中科院上海生物工程中心提供. 1.1.2 培养基 LB培养基用于试管种子培养［7］ ，含葡萄糖的2YT培养基用于摇瓶培养［7］ ，半合成培养基用于5L发酵罐中分批补料培养［8］ .补料基质含有（g L-1 ）:Trypton80，Yeast Extract40，Glycerol400，MgSO4 7H2 O5. 1.1.3 仪器 Biostat C5L自动发酵罐，德国B.Braun公司;J-6B型大容量冷冻离心机，Bechman公司产品;微量蛋白电泳仪，Bio-Rad公司产品;Ultrascan XL灰度扫描仪，LKB产品. 1.2 方法 1.2.1 发酵用菌种筛选 pBV