骨桥蛋白RGD黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化与生物学活性测定.pdfVIP

骨桥蛋白RGD 黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化及 生物学活性测定1 吴红玉，温进坤，韩梅 河北医科大学生物化学与分子生物学研究室，河北省医学生物技术重点实验室， 河北石家庄（050017 ） E-mail: wjk@ 摘 要：目的：用大肠杆菌表达骨桥蛋白RGD 黏附序列6 拷贝短肽，经分离纯化后检测其 生物学活性。方法：运用基因重组技术，将骨桥蛋白RGD 黏附序列的核酸片段首尾相连， 与携带GST 编码序列的原核表达载体连接构建融合蛋白表达质粒pGEX-3X-RGD 。将重组 质粒转化宿主菌后，对诱导融合蛋白表达的条件进行优化。表达产物GST-RGD 经谷胱甘肽 -亲和层析纯化后，分别检测其对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移的影响。结果： 所构建的含有 6 个拷贝短肽的 GST-RGD 融合蛋白可在大肠杆菌中以包含体的形式进行表 达。用十二烷基肌氨酸钠变性溶解包含体及透析复性后，经亲和层析可得到高纯度的 GST-RGD(6)融合蛋白。GST-RGD(6)融合蛋白能特异性的抑制骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细 胞的黏附和迁移。结论：骨桥蛋白RGD 黏附序列6 拷贝短肽可在大肠杆菌中高效表达，纯 化的GST-RGD 融合蛋白具有抑制血管平滑肌细胞黏附和迁移的活性。 关键词：骨桥蛋白；GST-RGD 融合蛋白；原核细胞表达；生物学活性 中图分类号：Q256 文献标识码：A 当血管内膜受损时，位于血管中膜的血管平滑肌细胞（vascluar smooth muscle cell, VSMC ）在生长因子和细胞因子的刺激下由收缩表型转化为合成表型，并获得向内膜下迁移、 [1] 增殖及合成和分泌大量细胞外基质（extracellular matrix, ECM ）的能力 。已经发现, 在新生 内膜形成过程中, 骨桥蛋白（osteopontin, OPN ）mRNA 的表达迅速上升, 细胞外基质中的 OPN 含量也显著升高[2]，这说明 OPN 在诱导 VSMC 的黏附和迁移中发挥着重要作用。作为 一种基质功能性蛋白, OPN 既是合成型VSMC 的重要标志, 是其合成和分泌的量最大的一种 细胞外基质成分，同时又是细胞黏附和迁移的分子基础。 OPN 分子中含有高度保守的细胞黏附序列，即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, 简称 RGD)序列， OPN 通过此序列与多种类型细胞的整合素受体相互作用而调节细胞的黏 附、迁移、增殖等多种生物学行为[3、4] 。业已证实，含 RGD 序列的短肽能够竞争性的抑制 OPN 与整合素受体的结合[5]，从而抑制 VSMC 以及炎性细胞的黏附和迁移。因此，这些小 分子肽在预防和治疗动脉粥样硬化、PTCA 术后再狭窄等血管重塑性疾病方面具有重要的应 用前景。但是，目前小分子肽主要靠人工化学方法合成，因价格昂贵而限制了其广泛应用。 为此，我们利用基因重组技术，将含有编码 RGD 序列的 cDNA 片段与携带谷胱甘肽 S-转移 酶（GST ）编码序列的原核表达载体进行重组，构建RGD 多拷贝重组子，将其转化大肠杆 菌表达 GST-RGD 融合蛋白，经分离纯化后获得 GST-RGD 纯品，为研究 RGD 多拷贝短肽 在防治 VSMC 黏附和迁移中的作用奠定了实验基础。 1. 材料与方法 1.1 材料 原核表达质粒 pGEX-3X 、E. coli DH5α菌株为本室保存，SD 大鼠由河北省实验动物中 1本课题得到国家自然科学基金项目，高等学校博士点基金（20040089018 ）和河北省自然科学基 金项目（C2006000814 ）的资助。 - 1 - 心提供，限制性内切酶 Bam H I ，Eco R I ，Bgl Ⅱ购自 TaKaRa 生物