定量RT-PCR原理幻灯片.pptVIP

Optional Date Name 竞争性RT-PCR PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性序列量的起始比例。 理想情况下，靶序列与参照物以相同的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开。 竞争性RT-PCR 参照物片段分两类: 同源性片段——与靶序列只有微小差别 非同源性片段——除两端引物－模板区以外与靶序列不同 竞争性RT-PCR面临的问题 变异主要来源是样品RNA的纯度和完整性，应设内源性参照物。 若使用DNA参照物，反转录酶的效率未受控制。 RT-PCR定量的条件 ?确定PCR反应曲线上的有效范围，即在平台效应出现以前PCR扩增得到的终产物与加入的RNA数量呈线性关系。 ?确定足够的样品数，保证可对PCR扩增产物量间差异进行统计分析。 非竞争性RT-PCR 目前主要采用荧光实时RT-PCR，放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。 实时RT-PCR 实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线。 根据PCR 变化曲线计算出目标靶基因分子数。 荧光测定的光学原理图 设置内参照 分为两种：在扩增反应中加入的外源参照物和样品中正常存在的内源参照物。 内源性参照物通常使用“管家” 序列或rRNA。 实时RT-PCR特点 ?扩增反应处于对数增长期，无平台效应。 ?无需处理PCR反应产物，减少污染。 ?检测范围更宽，速度更快。 Application ?Quantification Mutation/Allele detection Multiplex RT-PCR ? Detection of mRNA splice variants Mutation/Allele detection Use different reporter dyes One increase homozygosity Two increase heterozygosity Multiplex RT-PCR Advantage: Time and reagent saving Limitation: availability of multiple reporters excitation and detection ability 多重定量PCR结果 主要内容 1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用 荧光定量PCR实验荧光强度的计算公式 Rn=总荧光强度 RB=基本（空白）荧光强度 XO=靶基因起始拷贝数 EX=扩增效率（0 EX 1） n =扩增循环数 RS=每个荧光分子的荧光强度 达到阈值时的计算公式 RB, Rs 和 Ex 是确定的 Rn=RT=阈值 n=CT= 达到阈值时的循环数 阈值选择的推导原理 1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引 起的 2. 偶然误差的结果满足对数分布 3. 阈值 = 基线（背景）信号均值＋基线（背景）信 号标准偏差 x 10 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈 值的概率小于10－5 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩 增使得荧光信号强度可以测量得到 PCR 反应曲线 多色荧光技术 准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力： FAM：标记目的基因探针 VIC：标记第二个目的基因或IPC探针 TAMRA：淬灭基团 ROX： 内参比荧光 使用ROX内参比的效果 使用ROX内参比的好处 ROX荧光内参比的作用 以固定浓度存在于TaqMan PCR缓冲液中，常用ROX 荧光强度均一化(Normalize)： Rn = RReporter / RROX， ?Rn = Rn,sample – Rn,blank 影响荧光信号强度的因素包括： 光纤出口处的激光强度；管盖厚度、透光性 缓冲液和反应体积等 校正管间差异，保证实验结果的重现性 5’ Nuclease Multiplex Assay 阳性内对照(IPC) 为操作方便，取样一般以克或uL为单位 IPC一般选用基因组中单拷贝的管家基因，其定量结果代表了基因组的数量，也就是检材中细胞的数量。 ?CT = CT Sample - CT IPC将定量结果校正为以基因组为单位，不同样品之间具可比性。 阳性内对照(I