DNA提取和银染程序.docVIP

2.1.4同名异物小白菜的AFLP鉴定方法 模板DNA的：（CTAB法） 。2% CTAB提取液在水浴锅中预热至65。加热前在2% CTAB提取液中加入0.4%的巯基乙醇。 加入μl 2%的CTAB提取液ml的离心管中，，充分混匀后651小时，期间每隔10分钟轻轻摇动一次。注意：样品的量不能太多，否则CTAB加入的量太少，细胞裂解不充分。 冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）轻轻转动摇匀。 保持温度在18以上，1000rpm离心10分钟。注意：温度太低则DNA容易和CTAB结合而沉淀。 用大口径枪头缓慢吸取上清液，重复步骤（4），（5）使溶液中的蛋白和多糖沉淀充分。 用大口径枪头缓慢吸取上清液，加入μl异丙醇的2ml离心管。注意：吸取2/3的上清即可，不能吸取太多，防止将氯仿：异戊醇或沉淀吸入，降低DNA的纯度。 rpm离心10分钟加入1ml预冷的70%的乙醇漂洗2次，用无水乙醇漂洗1次。置于超净工作台上吹干1-2小时，或用冷冻真空干燥机抽干。 加入μl 0.1×TE或者水溶解DNAμl加入0.5μl的RNase（mg/ml）。(11) 取2μl DNA，以λDNA为对照进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度，稀释ng/μl左右，-20保存。（试剂的配置见附录）AFLP分析的操作步骤 (1) 基因组DNA的酶切和连接 基因组DNA的双酶切和接头的连接采用一步完成，其反应体系为μl，包括MseI(10U/μl) 0.5μl EcoRI(12U/μl) 0.5μl MseI 接头(50pmol/μl)1.0μl EcoRI 接头(5pmol/μl)1.0μl 10×ATP 1.0μl 10×NEB(buffer) 5.0μl BSA(10mg/ml) 0.25μl T4连接酶(U/μl) 0.5μl 基因组DNAμl) 3.0μl ddH2O 12.25ul 总体积.0μl 离心混匀，37℃酶切连接反应2小时10分钟接头的序列和配置见附录(7)。 (2) 预扩增 将酶切连接产物稀释20倍，按如下体系预扩增：MseI 接头(/μl) 0.3μl EcoRI 接头(/μl) 0.3μl 10×PCR Buffer 2.0μl MgCl2(25mmol/L) 1.5μl dNTP(10mmol/L) 0.4μl Taq polymerase(5U/μl) 0.2μl DNA模板4.0μl ddH2O 11.3μl 总体积20μl 混合后，离心数秒，按如下PCR程序扩增: 94℃ 5min 94℃ 30sec 56℃ 30sec 20 cycles， 72 1min 72℃ 7 min 60℃ 30min 4℃保存。 取μl预扩增DNA产物μl上样缓冲液(loading buffer)混合后在1.0%琼脂糖凝胶 1×TBE条件下检测预扩增的效果。μl预扩增产物加入95μl0.1×TE，混合-20℃保存备用。其余预扩增DNA产物，-20保存备用。 (3) 选择性扩增 扩增体系如下10×PCR缓冲液2.0μl MgCI2 （25mmol/L） 0.8μl dNTP(10mM) 0.45μl Taq酶(5U/μl)μl EcoRI引物(50ng/μl)1.2μl MseI引物 (50ng/μl1.2μl 模板DNA6μl 加超纯水至20μl 扩增程序为: 94 2min 94℃ 30sec 65℃ 30sec 13cycles，-/cycle 72℃ 1min 94℃ 30sec 56℃ 30sec 30cycles 72℃ 1min 72℃ 7min 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 将选择性扩增的产物20μl中加入变性上样缓冲液8μl（98%的甲酰胺，10mM的EDTA，0.25%的溴酚蓝，0.25%的二甲苯青），95变性5分钟，然后在冰浴中迅速冷却。在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶（配方见附录）上电泳1.5小时，电泳仪采用Bioab垂直电泳仪。加样量为8.5μl。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作规程： (1) 玻璃板的清洗 玻璃板是否清洗干净直接关系到聚丙烯酰胺凝胶灌制的质量，干净的玻璃板可以明显防止灌胶时产生气泡。最好提前用洗