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第三章 细胞形态结构观察技术 一、活体细胞的观察和摄影技术 1.倒置显微镜：P60图3-3（提问光镜使用注意） 适用：观察贴壁生长的培养中细胞 构造特点：因物镜置于观察标本下方而得名 技巧：调弱光亮度，集光器稍远些， 增大光线反差，对正光轴； 摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片 会更清晰。 底片选用正片，反差大 2.相差显微镜 P62图3-4 适用：可增强活细胞同背底反差，帮助看清 细胞的轮廓和细胞内细微结构，如： 核仁、染色质、线粒体等。 构造特点：有两个附加构件： 相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜 相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物 镜倍数一致 技巧：细胞培养瓶质地均匀透明较好，最好用塑 料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净；光轴对 正，照明度适宜，摸索试调至最佳 3.荧光显微镜 P67图3-6 适用：观察细胞内天然的荧光物质，如维生 素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与 荧光染料结合的细胞组分。 构造特点：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。 技巧：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本；选用效果最好的滤光片；荧光标本易褪色，不能长期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压汞灯光源启动后15分钟内不得关闭，关闭后，灯冷却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本时，需带护目镜。 4.暗视野显微镜 P64图3-5 适用：观察记录活细胞或细胞器的运动轨迹， 提高分辨率 构造特点：只有聚光器不同于普通显微镜，设 有一个中央遮光板使照明光线不能直射。 标本进入目镜，只许标本散射光进入目 镜 技巧：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔 径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光 镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。 二.显微摄影技术 p68 1.概念：显微摄影术是利用显微摄影装置拍摄 显微镜视野的物象的技术。 2.技术类型：胶片相机摄像 数码相机摄像 CCD图像采集 三者前期操作一致，但成像和图像存储 原理不同。 3.图像记录原理： 胶片相机摄像：显微摄影时，光线自标本 片的微小物件射入物镜后，造成一个倒立的放大实像，经目镜进一步放大后，投射在照相底片上，使底片感光而记录下显微镜视野下物象。 数码相机摄像：是以数字的形式用电子设备储存图像。拍照后，可通过数据线将所拍摄图像传输到电脑，也可将相机的存储卡取出，通过读卡器将拍摄的图像传输到电脑上。 数码相机摄像原理与CCD图像采集器相同。 CCD图像传感器：即CCD(charge copled Device, 感光耦合组件） CCD的组成结构有三个层次： 上层：聚光镜片（增光镜片） 中层：一个类似马赛克的网络（分色网络） 下层：垫在下层的电子线路矩阵（感应线路 是可记录光线变化的半导体） CCD工作方式之一： 当数码相机的快门开启，来自影像的光线穿过，这些马赛克会让感光点的=氧化硅材料释放出电子（正电）与电洞（负电）。经由外部加入电压，这些电子和电洞会被转移到不同极性的另一个硅区暂存。电子数的多寡和曝光点所接受的光量成正比。在一个影像最明亮部位，可有十万电子被积存起来。 CCD IMAGE SENSOR外形 彩色CCD的组成结构分图 CCD 的三层结构：上：增光镜片、中：色块网格 下：感应线路 由微型镜头、马赛克分色网格，及垫于最底层的电子线路矩阵所组成 4.拍摄技术步骤： 胶片相机拍摄：p69-74(生物教研室李相伟） 数码相机拍摄：p74-75(同上） CCD图像采集： （病理教研室姚海涛 （实验中心刘君星） 5.缩时显微摄影术