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碱性成纤维细胞生长因子对视网膜Müller 细胞表达 血管内皮生长因子的影响 1 1 2 1 1 艾静 ，刘瑶 ，陈平圣 ，栾洁 ，朱茂丽 1 东南大学临床医学院眼科学教研室，江苏南京 （210009 ） 2 东南大学基础医学院病理学教研室，江苏南京 （210009 ） E-mail ：greener666@126.com 摘 要：本文旨在探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ）对体外培养兔视网膜Müller 细胞 表达血管内皮生长因子（VEGF ）的影响。利用外源性的bFGF 干预Müller 细胞，采用免疫 细胞化学方法半定量检测bFGF 对视网膜Müller 细胞表达VEGF 的影响。结果显示，与空 白对照组相比，bFGF 上调体外培养的兔视网膜Müller 细胞VEGF 的表达，且具有一定的浓 度依赖性及时限性。提示bFGF 可以通过上调视网膜Müller 细胞表达VEGF ，从而推测bFGF 和VEGF 可能在糖尿病视网膜病变（DR ）新生血管形成中具有协同作用。 关键词：血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，糖尿病视网膜病变，细胞培养，免 疫细胞化学 1. 引言 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF ）和碱性成纤维细胞生长因 子(basic fibroblast growth factor , bFGF) 是视网膜中最重要的两种血管生成因子，视网膜多种 细胞分泌产生 bFGF 和 VEGF 。bFGF 不仅与 VEGF 具有协同作用[1]，还可以诱导内皮细胞 表达 VEGF[2] 。视网膜 Müller 细胞是视网膜中分泌 VEGF 的主要细胞之一，具有重要的生 理及病理学功能。为了进一步探讨 Müller 细胞在 DR 发生发展过程中作用，我们观察了 bFGF 对体外培养兔视网膜 Müller 细胞表达 VEGF 的影响，现报道如下： 2.材料和方法 2.1 细胞培养 [3] 参照刘瑶等报道的方法并稍加改进进行 Müller 细胞的分离培养并鉴定 。简述如下:取 重约 2.0-2.5 ㎏的健康新西兰大白兔，雌雄不限( 由东南大学医学院动物实验中心提供) 。经耳 缘静脉注入 10ml 空气处死，无菌条件下摘除眼球，快速解剖分离视网膜，制成微小组织块 进行贴壁培养。 细胞培养液为含 20 ％胎牛血清的 DMEM 培养液。培养环境为恒温恒湿培 养箱（37℃，含 5%CO2、95%空气）。 2.2 bFGF 作用观察 2.2.1 bFGF 的配制 重组人类成纤维细胞生长因子（rhbFGF 冻干粉，10µg）购自 PeproTech Asia 公司，用 单纯 DMEM 培养液配制成不同质量浓度的 bFGF 悬液。 2.2.2 实验分组 使用 P2 代培养细胞用于 bFGF 作用的实验观察,即原代细胞 80%融合后予以传代，传代 细胞调整密度约为 4～5×104 个·mL-1，接种至预置有盖玻片的六孔培养板中，置于恒温恒湿 培养箱中培养，待其贴壁生长至对数生长期时，予以换液，加入相同体积不同质量浓度的 bFGF 悬液及相同体积含 10％胎牛血清的DMEM 培养液,使每孔 bFGF 的终质量浓度分别为 0.1、1、10、50、100ng/ml。空白对照组仅加入含有 10％胎牛血清的DMEM 培养液，余条 件相同。 2.2.3 VEGF 免疫细胞化学 分别于 1d、3d、6d、9d 后取出部分盖玻片，pH7.2～7.6 PBS 清洗，冰丙酮固定，PBS 冲洗,3% H2O2 阻断内源性过氧化物酶，PBS 冲洗，5%BSA 封闭液封闭，甩去不洗；加入 兔源抗兔 VEGF 多抗，阴性对照加 PBS，4 ℃保湿过夜；