第五章 CRISPR实验流程.pdfVIP

CRISPR/Cas9 实验流程 交流企鹅: 2621697472 （大家做哪块？） 一、利用 Cas9 质粒建立 knock-out 细胞系实验的详细过程 1.1 确定待敲除基因的靶位点 1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo （引物） 1.3 构建表达sgRNA的质粒 1.4 sgRNA活性检测 1.5 利用 Cas9 质粒建立 knock-out 细胞系 1.1、确定待敲除基因的靶位点 根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE 中进行 查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS 的外显 子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除 位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将 基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物 性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果 是microRNA ，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA 的外显子 或在编码成熟microRNA 的外显子的5’和3’侧翼序列。 1.2、 设计识别靶位点的一对DNA Oligos 确定待敲除位点后，选择23-至250bp 的外显子序列输入到在线免费设 计sgRNA 的软件Input框中 （/），然后进行设计运算， 软件会自动输出sgRNA序列 （网站设计一般很慢或数据输出不完整， 可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般地， 基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列 （Protospacer Adjacent Motif ）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸 基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt 。而PAM序列的 特征为NGG （其中N为任意核苷酸）。因此， sgRNA模板序列选择非 常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件 可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位 点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板 序列。 根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时 设计检测目的基因的引物一起合成）。 1.3、 构建可表达sgRNA的质粒 （Precut SgRNA Cloning kit and pSD-gRNA Plasmid构建试剂盒） 企鹅: 2621697472 将合成的Oligos 以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质 粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。 次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆6个，溶于20ul LB液中，涡旋后， 将部分菌液接种到LB液中，37oC下250 rpm生长，另部分的菌液用作 模板进行快速PCR，经电泳确定阳性克隆后，将相对应的细菌送商业 公司测序，同时将部分菌液接种到LB液体，37oC下250 rpm培养过夜。 1.4、 sgRNA活性检测 1.4.1 sgRNA活性预检测--SSA活性检测 （Precut pSG-target Cloning kit SSA assay检测试剂盒） 企鹅: 2621697472 • SSA检测：根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率，客户也可 以选购我公司Precut pSG-target Cloning kit 自行构建报告载体用于检 测，我公司提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。 • 检测原理：SSA报告质粒(pSG-target) 中luciferase基因被终止密码子 提前终止，这种截短的luciferase没有活性。为检测sgRNA的剪切活性， 将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA 的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组 重新形成有活性的luciferase （Figure 2 ），通过检测luciferase 的活性升 高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性 （Figure 3 ）。 Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombination Figure 3.Increased FL/RL ra