人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达.pdfVIP

第 30卷 第6期 暨南大学学报(医学版 ) VO1．3O No．6 2009年 12月 JournalofJinanUniversity(MedicineF_Aiaon) Dec． 2oo9 人溶茵酶 N端与 Exendin一4嵌合蛋白的 基因克隆及原核表达 王 明 ， 刘宇婷2， 潘霞明 ， 曾可静 ， 朱元昌 ， 周羽垃 ， 刘 誉 (暨南大学医学院 1．生物化学教研室；2．临床医学系，广东 广州510632) [摘 要】 目的：克隆嵌合多肽人溶菌酶N端一Exendin一4基因并进行原核表达和纯化。方法：通过重组 PCR技术 将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin．4多肽基因序列相连接，其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶 识别位点组成的连接序列。以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒 pET-32a(+)构建原核表达体，转化大肠杆菌 BL21(DE3)并诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Westernblotting鉴定；透析复性后 ，以肠激酶切割并回 收目的多肽。结果：重组质粒pET-32a／hLYZ(N74)．Ex4构建正确，目的蛋白主要以包涵体形式存在，37℃诱导4 h、IPTG浓度为0．6mmol／L时表达量最高，约占菌体蛋白总量的30％。Westernblotting检测显示重组蛋白为单一 清晰条带。重组蛋白经肠激酶切割后，回收得到高纯度的嵌合多肽。结论：成功构建hLYZ(N74)一Ex4嵌合基因的 原核表达质粒，高效原核表达并获得高纯度 目的蛋白。 [关键词】 Exendin，4； 人溶菌酶； 嵌合多肽 ； 原核表达； 糖尿病 [中图分类号] R587．1；q78 [文献标志码] A [文章编号] 1000—9965(2009)06—0595一o6 Cloningandprokaryoticexpression ofhuman lysozyme N ·terminalfragment／Exendin-4chimericpeptide WANG Ming ， LIU Yu—ring ， PAN Xia—ming2 ZENGKe-jing2， ， ZHU Yuan—chang ， ZHOU Yu．bin ， LIU Yu (1．DepartmentofBiochemistry，2．DepartmentofClinicalMedicine，MedicalCollege， JinanUniversity，Guangzhou510632，China) [Abstract] Aim：Toclone，expressandpurifychimericpeptideofhumanlysozymeN—terminalfrag— ment／exendin一4．Methods：HumanlysozymeN—temrinalfragment(1—74aa)andexendin一4genese— quenceswerelinkedbyusingrecombinantPCR．Thelinkersequencebetweenthelysozymefragmentnad exendin一4containedasiterecognizedbythrombinandnaothersitebydipeptidylpeptidaseIV (DPP VI)．ThehLYZ(N74)-Ex4genewasinsertedintoprokaryotieexpressionvectorpET-32a(+)，Pans— formedintoE．coliBL21(DE3)nadinducedwihtIPTG．Theexpressedpro