半夏蛋白抗肿瘤活性组分的提取分离论文.docVIP

　　半夏蛋白抗肿瘤活性组分的提取分离论文 .freelol/L和0.1 mol/L NaCl的洗脱峰呈现较好的量效关系,且对Bel-7402细胞的抑制作用与空白对照组有显著性差异。30%硫酸铵沉淀蛋白有促进Bel-7402细胞凋亡的作用。结论 半夏蛋白中30%硫酸铵沉淀部分对Bel-7402细胞生长具有明显抑制作用及促进Bel-7402细胞凋亡的作用。 【关键词】 半夏；Bel-7402细胞；抗肿瘤蛋白组分；抗肿瘤活性测定 Abstract：Objective To isolate the anti-tumor protein groups from Pinellia ternata rhizome and investigate the anti-tumor activity of these protein groups on Bel-7402 cell. Methods The total ran chromatography. Methyl-thiazolyl-tetrazolinm (MTT) or cells. Apoptosis etry (FCM). Results The 30% and 60% (NH4)2SO4 deposition part of total proteins from Pinellia ternata rhizome have no certain relationship betol/L or 0.1 mol/L NaCl from 30% (NH4)2SO4 deposition part sho Pinellia ternata rhizome could significantly inhibit Bel-7402 groor protein groups；assay of anti-tumor activity 半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.的块茎,含有生物碱1、有机酸2、半夏蛋白3和多种氨基酸4等成分。本实验从鲜品半夏中分离得到一组活性蛋白组分,并对其体外抗肿瘤活性强度进行了测定,.freelresco公司)；MTT、PI(Sigma公司)；其它化学试剂均为分析纯。DEAE Sepharose FF(Amersham Biosciences)；DHL-A电脑恒流泵、DBS-100型电脑全自动部分收集器、HD-3紫外检测仪(上海沪西分析仪器厂)；752N型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；TGL-16G-A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；SI1640,在37 ℃、5% CO2的孵箱中培养。 1.4 半夏蛋白的提取分离 1.4.1 硫酸铵沉淀粗蛋白 新鲜块茎半夏洗净去皮,加入4倍体积0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液及少量石英砂高速匀浆。4 ℃、8 000 r/mim离心30 min,收集上清液,即得粗蛋白。粗蛋白冷却至0 ℃,逐步加入固体(NH4)2SO4,当饱和度达到30%时,4 ℃静置2 h后8 000 r/mim离心30 min,收集沉淀,得第1个分级沉淀部分。上清液继续加(NH4)2SO4至60%饱和度,4 ℃静置2 h后8 000 r/mim离心30 min,收集沉淀,得第2个分级沉淀部分。上清液加(NH4)2SO4至90%饱和度,静置,无沉淀产生。将上述2个分级沉淀部分分别用蒸馏水溶解,装入透析袋(透过分子量8 000),用蒸馏水在4 ℃透析脱盐,更换透析液至检测不出(NH4)2SO4为止,把透析袋放入吸水性强的聚乙二醇(PEG,分子量20 000)中,浓缩至小体积,离心后去除沉淀。 1.4.2 30%硫酸铵沉淀部分的凝胶层析分离 将DEAE Sepharose FF胶装入层析柱中,用0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液平衡树脂,将30%硫酸铵沉淀部分溶解后以0.5 mL/min上柱,分别以0.05 mol/L Tris-HCl、0.05 mol/L NaCl、0.10 mol/L NaCl、0.15 mol/L NaCl、0.20 mol/L NaCl溶液以1 mL/min速度洗脱,用HD-3紫外检测仪测定A280,共出现4个比较明显的吸收峰(见图1),分别自半峰高收集各组分,透析脱盐,浓缩,得到各组分蛋白样品。用紫外分光光度计于280 nm和260 nm波长分别测各样品吸光度,按下式计算各组分蛋白样品中蛋白含量7。 1.5 体外抗肿瘤活性测定 1.5.1 MTT法测定 将对数生长期的细胞接种于96孔培养板中,浓度为2×104个/mL,每孔接种180 μL,继续培养24 h后,加入待测蛋白样品(见表1),加样终