多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析论文.docVIP

　　多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析论文 .freeline Abstract:AIM To study the mechanism of dopaminergic neuronal death of Parkinson’s diseases（PD）.METHODS Using the floetry，electron microscope，elec-trophoresis and the immunohistochemistry technology，istry of the apoptosis on PC12cells induced by dopamine ine（DA）induced apoptosis in PC12cell.The early al-teration itochondrion and the expression of bcl-2anti-apoptosis protein.Then the specific nuclear ultrastructure of apoptosis and the typical DNA“ladder”electrochromatography ay be involved in the pathogenesis of PD，and the mitochodria plays a significant role in the early apoptosis of cells. 0 引言 帕金森病的特征性病理改变为黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性死亡、缺失.其具体机制迄今尚不完全明确.freelL L-1 胎牛血清，谷氨酰胺2mmol L-1 ，青霉素50ku L-1 ，链霉素25mg L-1 ，培养瓶中预先铺以200mg L -1 鼠尾胶，用于细胞传代，置于50mL L-1 CO2 孵箱37℃培养，隔天换液. 1.2 药物处理 待PC12细胞生长良好时加入多巴胺0.5mmol L-1 ，同时将部分细胞置于培养皿中，进行细胞爬片.空白对照组加入RPMI-1640培养液.分别培养12及24h. 1.3 形态学观察 分别取0.5mmol L-1 多巴胺培养12h及24h的细胞片，福尔马林固定30min，0.01mmol L -1 PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，HE染色光镜下观察. 1.4 流式细胞仪检测 分别取0.5mmol L-1 DA处理12及24h的细胞液经2.5g L-1 胰酶和2.0g L-1 EDTA液消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度1×109 L-1 ，离心后弃去上清液，重悬浮于5mL，4℃预冷的葡萄糖盐水中，按每1mL悬液加入2mL4℃冷乙醇的量固定24h，按1∶1加入碘化丙啶（PI）染色，4℃放置25min，流式细胞仪中进行分析. 1.5 免疫组织化学bcl┐2染色 应用SABC 试剂盒，将细胞片置于30mL L-1 H2 O2 中常温处理10min;蒸镏水洗涤3次;加入血清封闭液20min;加入bcl-2抗体37℃1h;0.01mmol L-1 PBS洗涤3次;加入生物素化二抗37℃20min;PBS洗涤3次;加入SABC 试剂37℃20min;PBS洗涤4次;DAB显色;苏木素轻度复染，脱水封片镜检. 1.6 电镜检查 分别将0.5mmol L-1 DA处理12及24h的细胞悬液离心后弃去上清，加入30mL L-1 戊二醛固定30min，送电镜室做超薄切片，JEM-2000EX型透射电镜下观察照相. 1.7 DNA凝胶电泳 分别取0.5mmol L-1 DA处理12及24h的细胞液，调整细胞浓度5×109 L-1 ，裂解液裂解，RNAase，蛋白酶K孵育，酚抽提，乙醇沉淀，每样品提取DNA10μg经琼脂糖凝胶行电泳分析. 2 结果 2.1 形态学观察 0.5mmol L-1 多巴胺作用12h细胞HE染色形态学无明显改变，可见核分裂相减少（1个/HP）.24h则呈典型凋亡形态学改变，可见凋亡小体.空白对照组细胞生长旺盛，核分裂相明显（6个/HP）. 2.2 流式细胞仪检测 0.5mmol L-1 多巴胺作用PC12细胞12h时流式细胞仪检测未见凋亡峰，但同空白对照组比较“S”期细胞明显下降，由38.7%下降为16.1%，表明细胞增殖明显抑制.而0.5mmol L-1 多巴胺作用PC12细胞24h时流式细胞仪检测可见典型亚二倍体凋亡峰（AP），凋亡率为47.6%（Fig1～4）. 图1 －图4 略 2.3 免疫组化bcl┐2表达 在0.5mmol L-1 多巴胺作用的PC12细胞中，无论12h还是24h光镜下均可