大鼠窦房结周围组织缝隙连接蛋白Cx43表达的增龄性变化论文.docVIP

　　大鼠窦房结周围组织缝隙连接蛋白Cx43表达的增龄性变化论文 程功，孙超峰，黄欣，杜媛，张军波，王永红 【关键词】 窦房结；年龄因素；,Cx43；窦房结传导时间 Agerelated changes of Cx43 proteins in the region around the sinoatrial node of rats 【Abstract】 AIM: To observe the change of sinoatrial conduction time(SACT) and protein expression level of Cx43 in the region around sinoatrial nodes(SAN) in neonatal, adult and old SD rats, and to explore the molecular basis of SAN electrophysiological reconstruction. METHODS: The rats continuous frozen sections. Four neighboring sections ed at the 2 middle sections. Immunohistochemical technology arked antibody of H4 and Cx43. Cx43 easured icroscope. RESULTS: ① SACT(ms) olecular mechanism of agerelated SAN functional regression. 【Key厚的连续冰冻切片. 相邻4张为一组，分别行HE染色、Masson染色、FITC标记抗Cx43和抗H4的免疫组化法染色，激光共聚焦显微镜测量Cx43荧光强度. 结果： ① 随年龄增长，SACT(ms) 延长（幼年15.2±2.2, 成年17.6±1.6,.freelo成年鼠（西安交通大学医学院实验动物中心提供）和30 mo老年鼠（四川省医学科学院实验动物研究所提供），常规饲料（西安交通大学医学院实验动物中心提供），Cx43蛋白特异性一抗（Rabbit antiCx43，美国Sigma公司），H4蛋白特异性一抗（Rabbit antiH4，美国chemicon公司）, IgG特异性二抗（Goat antiRabbit IgG）和多聚赖氨酸（美国Sigma公司），水溶性封片剂（武汉博士德公司），HM500O型冰冻箱切片机（德国ZEISS公司），TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜和LEICA Q550Casson染色，另两张分别行免疫组化染色，晾干切片，PBS洗去OCT, 40 g/L多聚甲醛固定30 min, PBS洗10 min×3次，10 g/L tritonx100PBS浸泡30 min，PBS洗10 min×3次，山羊血清室温下封闭1 h，行免疫组化染色的两张切片分别加上特异性一抗（兔抗Cx43抗体，稀释比例为1∶3000；兔抗H4抗体，稀释比例为1∶200），置于湿盒中4℃过夜. PBS洗10 min×3次，分别加FITC标记的山羊抗兔IgG特异性二抗，置于37℃恒温箱中50 min，PBS洗10 min×3次，水溶性封片剂封片，立即在激光共聚焦显微镜下观察，在495 nm波长时激发，在525 nm波长时可见组织片上产生绿色荧光. 1．2．2．3Cx43表达水平的测定利用激光共聚焦显微镜观察，可见Cx43分布于窦房结以外心房组织，窦房结区无表达，在窦房结与周围界嵴和腔静脉窦连接处，选取5处区域测量Cx43荧光强度值，计算其平均值，减去阴性对照组织片中相应部位的荧光强度值后，即得到了实际荧光强度值. 统计学处理： 计量数据用x±s表示，用SPSS11.0软件包进行统计分析. 3组均数的比较采用单因素方差分析，若3组之间有统计学差异，则进行组间LDS-t检验，P 0.05视为有统计学意义. 2结果 2．1大鼠SACT的增龄性改变3组大鼠SACT方差分析显示有显著性差异(P 0.01)，说明随年龄增长，大鼠SACT延长. 用LDS test统计方法对大鼠SACT(ms)进行组间分析，幼年(15.2±2.2),成年（17.6±1.6）,老年（19.3±0.9），两两间比较有统计学显著性差异(P 0.01). 2．2大鼠窦房结周围组织Cx43表达的增龄性改变激光共聚焦显微镜下观察，产生荧光的部位有Cx43表达，结合相邻组织片抗H4抗体染色，以及HE染色、Masson染色，即可见Cx43分布于窦房结以外心房组织，窦房结区无表达，未发现Cx43阳性的心房肌延伸到H4阳性的窦房结区，产生的绿色荧光呈短线状分布于相邻心房肌细胞闰盘处