大鼠脑干DVC区注射ghrelin对弓状核NPY mRNA及AgRP mRNA表达的影响论文.docVIP

　　大鼠脑干DVC区注射ghrelin对弓状核NPY mRNA及AgRP mRNA表达的影响论文 陈新科李清春陈曦蒋正尧管洪在 【摘要】目的探讨脑干迷走神经复合体(DVC)区微量注射ghrelin对摄食的影响及其可能机制。方法72只雄性SD大鼠随机分成给药组和正常对照组，每组36只大鼠，行DVC区埋管手术，术后恢复7d。7d后给药组大鼠DVC区微量注射20pmol的ghrelin，正常对照组大鼠DVC区微量注射等体积生理盐水。两组分别于给药后1、2、3h取大鼠下丘脑提取RNA，应用荧光定量PCR方法检测大鼠下丘脑弓状核神经肽Y（NPY）及刺鼠色蛋白相关蛋白（AgRP）mRNA的表达情况。结果给药组大鼠给药后1、2、3h下丘脑NPYmRNA和AgRPmRNA的表达水平均明显高于正常对照组，差异有显著性（t=2.79～9.12，P 0.05）。给药组大鼠给药后2h下丘脑NPYmRNA和AgRPmRNA的表达水平明显高于给药后1h及3h组（F=16.55、10.45.freelRNA和AgRPmRNA的表达水平比较差异无显著性(P 0.05)。结论作用于大鼠DVC区的ghrelin可能通过下丘脑弓状核NPY、AgRP神经通路促进摄食活动。 【关键词】Ghrelin；下丘脑；弓状核；神经肽Y；刺鼠色蛋白相关蛋白；大鼠 hrelin是生长素促分泌素受体（GHSR）的内源性配体，由28个氨基酸组成，在饮食的控制中发挥着重要的作用。已有研究表明，外周和脑室注射ghrelin都可使摄食量明显增加。尽管GHSR分布在脑中枢的多个区域,但目前绝大多数研究认为，无论中枢还是外周ghrelin促进摄食作用都是通过下丘脑弓状核神经肽Y（NPY）、刺鼠色蛋白相关蛋白（AgRP）神经元上的GSHR介导的1。KIMBERL等2在大鼠第三脑室和第四脑室注射ghrelin后明显地增加了下丘脑弓状核NPY的表达，但是第三脑室和第四脑室相互交通，注射在任何一个脑室的药物均有可能弥散到另一个脑室，从而影响结果的分析。最近ZIGMAN等3用原位杂交法的研究结果表明，在大鼠迷走神经复合体（DVC）区的3个组成部分：孤束核、迷走神经运动背核和最后区均有GHSR的表达。FAULCONBRIDGE等4在大鼠右侧DVC区注射10pmolghrelin获得相当于下丘脑弓状核注射30pmol的摄食增加反应，提示在中枢ghrelin诱发的多食反应中，DVC可能和下丘脑弓状核同样重要。本文采用荧光定量PCR的方法检测大鼠DVC区微量注射ghrelin后下丘脑NPYmRNA及AgRPmRNA表达的变化，进而探讨脑干DVC区微量注射ghrelin促进摄食的可能机制。现将结果报告如下。 1材料和方法 1.1动物与分组 健康成年雄性SD大鼠72只，体质量250～350g，由山东中医药大学实验动物中心提供。随机分成给药组和正常对照组，每组又根据注射后检测间隔时间的不同分为3个亚组，即1h组、2h组和3h组，每个亚组12只大鼠。给药组大鼠DVC区埋管后微量注射20pmolghrelin，正常对照组DVC区以相同方法埋置套管，微量注射等体积生理盐水。 1.2主要试剂与仪器 Ghrelin购自美国肽公司（AmericanPeptidepany,INC），生理盐水溶解。TRIzol购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自MBI公司。SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒购自TOYOBO公司。荧光定量PCR仪为ABI7500。立体定位仪为日本Narishige公司生产。紫外线分光光度计为EppendorfBiophotometer公司生产。引物由上海生工合成，序列如下：内参照βactin上游引物5′CCATCCAGGCTGTGTTGTCC3′，下游引物5′GCTTCTCTTTAATGTCACGCACG3′；PCR产物长度为243bp。NPY上游引物5′TGTGGACTGACCCTCGCTCTAT3′，下游引物5′TGTAGTGTCGCAGAGCGGAGTA3′；PCR产物长度为139bp。AgRP上游引物5′AGCTTTGGCAGAGGTGCTAGATC3′，下游引物5′TGCCAGTACCTAGCTTGCGG3′；PCR产物长度为173bp。 1.3实验方法 1.3.1DVC区埋置套管SD大鼠在(22±1)℃室温下，保持12h白天、12h黑夜循环的环境下饲养，自由饮水和进食。手术当天，大鼠用80g/L水合氯醛(400mg／kg)腹腔麻醉，俯卧位，固定在立体定位仪上，头部正中切口，剥离骨膜，使前后囟位于同一水平面。用三棱针在颅骨表面钻孔，清除脑膜，参照大鼠脑图谱5，将长15mm、内径0.3mm、外径0.4mm的自制