大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建论文.docVIP

　　大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建论文 【摘要】 分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株，为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。［方法］采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞，利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T／PUR转染骨骺干细胞，经嘌呤霉素筛选，抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3抗体和PA抗体进行免疫细胞化学染色，观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线。用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达。［结果］转染后获得一个阳性细胞克隆，免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性。SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞。转染细胞经扩大培养，命名为永生化骨骺干细胞。［结论］成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株。 【关键词】 骨骺干细胞 永生化 猿肾病毒40 Abstract：［Objective］To separate rat precartilaginous stem cells (PCSCs) and establish immortalized precartilaginous stem cell(IPCSC) strain arker (anti-FGFR-3) of PCSCs munocytochemistry. Plasmids pCMVSV40T/PUR containing the simian virus 40 large T antigen gene (SV40Tag) ethod. Colonies ycin selection and amplified to cell strain.The expression of SV40Tag in the amplified cell strain munocytochemistry and RT-PCR. Anti-FGFR-3 and anti-PA ycin selection.［Result］One anti-puromycin cell clone ed as FGFR-3 positive PCSCs RNA and protein expression s of SV40Tag plified to immortalized cell strain maintained for more than 30 passages, named immortalized precartilaginous stem cells(IPCSCs). The population doubling time and anti-PA positive confirmed the high capability of proliferation.［Conclusion］Rat precartilaginous stem cells mortalized precartilaginous stem cell strain cells; immortalization; simian virus 40 骨骺干细胞(precartilaginous stem cells.freelbryo MaxTM-DMEM干细胞专用培养基、pleteTM Trypsin Solution购自CHEMICON公司；EGF、bFGF购自Cytolab公司；胎牛血清、青-链霉素购自Gibico公司；Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司；兔多克隆抗体FGFR-3(c-15)购自Santa Cruz公司；质粒pCMVSV40T／PUR和大肠杆菌菌株分别获赠于瑞典Jan Holgersson教授和同济医院田玉科教授；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；内切酶NotI和XhoI购至Toyobo公司；Trizol试剂盒购自GIBCO公司；兔抗鼠SV40Tag抗体和兔抗鼠anti-PA购自NeoMarkers公司；SP9000免疫组化试剂盒、ZLI29032浓缩型DAB试剂盒和FITC标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉公司。 1.1.2 引物设计 根据大鼠基因序列设计内参β-actin引物，上游：5-GTTGACATCCGTAAAGACC-3，下游：5-CACCAATCCACACAGAGTA-3，产物长度为170 bp；根据SV40Tag基因序列设计引物，上游：5-TATCTTFCAGGT TCAGGG-3，下游：5-TGGAATAGTCACCATGAATG-3，产物长度为558 bp。引物由上海生工公司合成。 1.2 方法 1.2.1 PCSCs的分离与鉴定 参考黄仕龙等的方法，以显微手术器械剪