大鼠重症肌无力中枢损害时c┐fos基因表达论文.docVIP

　　大鼠重症肌无力中枢损害时c┐fos基因表达论文 .freelyasthenia gravis;receptors，cholinergic;anti-bodies;genes.freel;rats Abstract:AIM To explore the mechanism of central ner-vous system（S）dysfunction in myasthenia gravis（MG）.METHODS c-fos expression munohistochemical method folloinistration of IgG purified from MG pa-tient sera.RESULTS Strong expression of Fos pus，hypothalamus et al after intracerebroventricular administration of IgG（AChab）.CONCLUSION It is concluded that c-fos may be related to the mechanism of S dysfunction in MG. 0 引言 重症肌无力（MG）主要的致病机制是患者体内存在的乙酰胆碱受体抗体（AChRab）与神经肌肉接头（NMJ）处的乙酰胆碱受体（AChR）结合，而引起NMJ处乙酰胆碱（ACh）传递障碍［1］ ，出现肌无力等临床症状.然而，有研究表明MG病变部位并不局限于NMJ处.有研究表明，部分MG患者伴有中枢神经系统（S）的异常，如锥体束征、癫痫、精神症状、记忆认知障碍［1-7］ 及脑电图及脑干诱发电位异常［8-10］ .Brenner等将从MG患者血清中提取的IgG注入大鼠侧脑室，发现其不仅影响下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，而且还出现MG模型样症状［11］ .此外，Lefvert等的研究表明，MG患者脑脊液中存在AChRab［12］ .上述研究提示MG患者AChab可引起S功能异常，但机制不甚明了.为进一步探讨MG的S受损机制，作者用MG患者AChab进行免疫组化研究发现，AChab可与S神经-AChR免疫交叉结合［13］ .本项研究，以能够反映神经元功能变化的原癌基因c-fos的表达作为神经元兴奋的指标，观察其在大鼠MG中枢损害时的变化，以求进一步在形态学上探寻MG S受损的证据. 1 材料和方法 1.1 实验动物 用成年雄性SD大鼠24只，体质量200～250g，（由本校实验动物中心提供），安静数天，给予充足、清洁的饮水，严密观察摄食和健康状况.实验组大鼠14只，对照组10只. 1.2 提取IgG 选择具有典型MG临床症状，抗胆碱酯酶药物实验和血清AChRab阳性的全身型MG患者为抽血对象.取患者血清10mL，用硫酸铵盐析法及亲和层析法提取IgG.另取健康人血清10mL，提取IgG，方法同上，作为对照. 1.3 大鼠脑室内注射IgG 选成年SD大鼠14只，用10g L-1 戊巴比妥钠经腹腔麻醉（30～40mg kg-1 体质量），固定于立体定向仪上，切开颅顶皮肤，暴露颅骨.自Bregma点向后1.3mm，向左旁开1.3mm处为脑室穿刺点.钻颅，自脑表面进针4.0mm，缓慢注入25uL MG患者IgG，隔日1次，共3次.对照组脑室内注入正常人IgG，方法同上.观察脑室内注入IgG前后SD大鼠行为变化，如摄食、体质量、四肢运动、呼吸频率及动度等. 1.4 组织准备 第三次注射IgG后5h，用10g L-1戊巴比妥钠经腹腔麻醉SD大鼠，经主动脉灌注40g L-1 多聚甲醛固定;取脑组织，置于200g L-1 蔗糖溶液中过夜;冰冻切片，片厚40nm. 图1 － 图6 略 1.5 免疫组织化学 先用PBS洗切片，10min×3次，入含3g L-1 TritonX-100的PBS中，室温下30min，然后入Fos抗体（美国Santa-Cruz公司，1 1000稀释），4℃下孵育36～72h;以PBS洗切片，10min×3次，入生物素化的羊抗兔二抗（美国Dako公司，1 500稀释），室温下孵育4h，PBS洗，10min×3次;再入ABC复合物（美国Dako公司，1 500），室温下孵育2～4h，PBS洗切片，10min×3次，再用硫酸镍铵强化法呈色.最后脱水、透明、封片（Fig1～6）. 1.6 图象分析 以Quantimet570图象分析系统（Leica公司）进行分析，分别计4张下丘脑、海马及皮层平面的Fos免疫反应细胞. 2 结果 实验组SD大鼠脑室内第3次注入MG患者IgG后脑内有多个脑区可以见到大量的Fos阳性神经元.第