抗原的提取与制备-培训课件.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 可溶性抗原的制备与纯化 1、处理与粉碎 2、蛋白质分离富集 3、单一组分提取 4、抗原纯度鉴定 （蛋白质、糖蛋白、脂蛋白） 处理与粉碎 组织粉碎： 机械 高速捣碎机 ，研磨 生物 酶消化（蛋白酶、胶原酶 ） 细胞破碎： 物理 反复冻融 ，冷热交替 ，超声 化学 表面活性剂 生物 溶酶，自溶 蛋白质分离 选择性沉淀： 盐析，有机溶剂沉淀， 水溶性非离子型聚合物沉淀（聚乙二醇） 透析技术：半透膜 超滤技术：负压+滤膜 单一组分提取的方法 层析技术：凝胶过滤 离子交换 亲和层析 凝胶层析（分子筛） 离子交换层析 + + + — — — — — — — + + + + + + + + — — + + + — — + + 亲和层析 单一组分提取的方法（续） 离心技术：差速离心 密度梯度离心 电泳技术：电泳洗脱 等电聚焦 密度梯度离心法 控制溶液的比重，将不同比重的分子或细胞通过离心方法加以分离 分为： *不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法） *连续密度梯度离心法 不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法） 分离液仅形成单一的密度层，可在该层中获取与其比重一致的细胞或分子。 该法较多用于外周血单个核细胞的分离，常用的分离液为Ficoll。 聚蔗糖－泛影葡胺 不连续密度梯度离心分离法 连续密度梯度离心法 分离液可形成一连续的密度梯度层，在不同的密度梯度层中可获取所需的不同种类的细胞。 该法可一次分离得到几种所需的不同类型血细胞。常用于外周血细胞的分离，使用的分离液为Percoll。 聚乙烯吡咯烷酮 连续密度梯度离心分离法 单一组分提取的方法 电泳技术： 电泳洗脱：根据蛋白质的电荷和分子大小分离 等电聚焦：根据蛋白质的等电点分离 电泳技术(等电聚焦) 抗原纯度鉴定 方法： 电泳法 免疫法 层析法 指标： 电泳纯（电泳法） 免疫纯（免疫扩散法，纯度要求高） 第三节 半抗原免疫原制备的方法 一、载体的选择 二、半抗原与载体的联接 载体的选择 结构复杂的大分子 蛋白质载体： BSA、HSA、OVA（卵清蛋白 ）、KLH（钥孔嘁血蓝蛋白 ） 聚合多肽载体：多聚赖氨酸 高分子聚合物载体：羧甲基纤维素 半抗原与载体的联接 1、连接方式：物理法（吸附） 化学法 2、化学连接方法： 直接联接法：适用于带游离氨基或游离羧基的半抗原 间接联接法：适用于没有游离氨基或游离羧基的半抗原 半抗原与载体直接联接 碳化二亚胺法 蛋白质-COO— + R-N+=CN-R` H-N+-R 蛋白质-COO-C-NH-R` + 半抗原-NH2 O 蛋白质-C-NH-半抗原 + R-NH-CO-NH R` 半抗原与载体直接联接 戊二醛法 蛋白质- NH2 + 半抗原-NH2 + COH-（CH2 ） 3 - COH 蛋白质-N=CH-（CH2 ） 3 – CH=N-半抗原 半抗原与载体直接联接 氯甲酸异丁酯法 半抗原-COOH + Cl-COO-CH2 CH（CH3）2 O O 半抗原-C-O-C-O-CH2CH（CH3）2 + 蛋白质- NH2 半抗原-CO- NH -蛋白质 + HO-CH2CH（CH3）2 半抗原与载体间接联接 琥珀酸酐法 O O 半抗原-CH2 –OH + C-O-C