第十一章高效液相色谱法HPLC.ppt

一 高压输液系统 1 高压泵 要求 输出压力高 平稳、脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀 * * 第十一章 高效液相色谱法 (HPLC) §11-1 概述 ?高效液相色谱法与经典液相色谱法 经典液相柱色谱装置 高效液相色谱仪 3-10 μm 高压泵 快(1-10mL/min) 150-200 μm 重力或低压泵 很慢 固定相粒径 流动相驱动方式 流动相流速 HPLC 经典液相色谱 例：分离20种氨基酸 柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: 20 h 经典柱色谱 HPLC t分离：1 h §11-2 基本理论 一 色谱柱柱效的基本关系式 二 分离度 三 速率方程 溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一 流动相流速对板高的影响 小颗粒填料，填充均匀； 选择较低的流动相流速； 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。 修正的速率方程： 提高柱效途径 §11-2 高效液相色谱分离方法 一 吸附色谱法 1 分离原理 Kad值越大，保留时间越长。 2 固定相 硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX) 固体吸附剂 硅胶表面结构 硅胶表面结构经热处理发生的变化 3 流动相(洗脱剂) 越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。 溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能 溶剂强度参数 硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯 流动相： 干燥正庚烷 1份水饱和的正庚烷 2份干燥正庚烷 水饱和的正庚烷 改变流动相的 组成可改变分离 的选择性 4 应用 ?具有不同官能团的化合物 ?具有相同官能团，但数量不同的化合物 ?异构体 例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序： 邻位间位对位 邻硝基苯胺 间硝基苯胺 对硝基苯胺 适合分离的物质 二 分配色谱法 分离原理 K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关 固定相极性流动相极性 正相分配色谱 组分极性越大，保留时间越长 反相分配色谱 固定相极性流动相极性 组分极性越小，保留时间越长 三 离子交换色谱法 阳离子交换树脂 阳离子交换 阴离子交换 1 分离原理 2 固定相 阳离子： －SO3H(强) －CO2H(弱) 阴离子： －N+R3(强) －NH2 (弱) 基质 合成树脂 纤维素 硅胶 离子交换剂 3 流动相 水相缓冲液+有机改性剂 调节选择性的主要参数 盐种类及浓度 pH值 各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序： 用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快 4 应用 离子及可离解的化合物 如氨基酸、核酸、蛋白质等 四 化学键合相色谱 采用化学键合相的液相色谱 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。 特点 1. 键合固定相制备 ODS(C18)键合相 硅胶 十八烷基氯硅烷 非极性 硅烷化反应 使用pH范围： 2-8 键合固定相类型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等 离子交换基团 胺基、季铵盐 磺酸、羧酸 2. 键合相色谱法分类 ?反相键合相色谱: 常用固定相：C18 分离对象 非极性 中等极性化合物 常用流动相 甲醇-水 乙睛-水 反相键合相色谱 疏溶剂分离机制 固定相极性流动相极性 ?正相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 ?离子性键合相色谱 将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。 例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水 出峰顺序：苯酚，甲苯 出峰顺序：甲苯，苯酚 十八烷基键合相 二醇基键合相 保留时间： 例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。 没食子酸 3,4-二羟基苯甲酸 固定相: 非极性; 流动相: 极性 组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸没食子酸 五 尺寸排阻(凝胶)色谱法 排阻色谱分离示意图 相对分子质量差别 大于10％的化合物 才可以分离 1 分离原理 2 固定相 是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。 凝胶 3 流动相 不采用改变流动相组成的 方法控制分离度 分离方法的选择 §11-3 高效液相色谱仪 高压泵 流动相溶剂 废液 色谱柱 进样口 检测器