纤维素降解菌的筛选和纤维素酶基因的克隆表达.pdfVIP

浙江师范大学硕士论文 lIIII I III II IlllI IIl UI Y1 纤维素降解菌的筛选和纤维素酶基因的克隆表达 摘 要 纤维素是地球上含量最多的可再生资源，然而由于一些关键技术瓶颈造成了 纤维素资源没有得到充分的利用，并且由于纤维素的燃烧、堆积等造成了环境的 污染。随着资源的紧张、对环境问题的重视，人们对纤维素酶研究的投入也在加 大。我们希望通过我们的力量，对纤维素酶的基础研究能够做出一定的贡献。 本研究先通过摸索建立了适合本研究的纤维素降解菌的筛选模型，并利用此 模型筛选出了9株纤维素降解真菌，经过滤纸条崩解实验和cellulose．azure降解 实验复筛，最后得到了2株降解纤维素比较好的纤维素降解菌。 通过分子生物学的方法，对这2株纤维素降解菌进行的鉴定。PCR扩增菌 株的18SrDNA，进行序列的比对和系统进化树的构建。经过鉴定这2株菌分别 为紫青霉(Penicillium purpurogenum)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。并对这2 株菌所产的纤维素酶的酶学性质进行了初探，测定酶活、温度和PH值对酶学性 质的影响。这2株真菌的内切酶活性在液体培养基发酵条件下的酶活性分别为 可以耐受70℃的高温，在酸性条件下可以起作用基本上可以看作是在极端条件 下能够起作用的酶。 紧接着，我们克隆了烟曲霉纤维二糖水解酶CBH基因到PET28(a)表达载 体上。并转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过SDS．PAGE电泳分析， 获得52KDa表达蛋白，与所预测的蛋白大小相符合。对纯化蛋白的酶学活性进 一步研究表明，烟曲霉纤维二糖酶最适pH值为4到6，最适温度为70℃。在80C 保持一个小时的条件下，酶活性依然可以保持80％以上。所以，烟曲霉纤维二糖 酶属于极端条件下能够起作用的酶。 关键词：纤维素酶；菌株筛选：基因克隆；蛋白质表达：蛋白质纯化 III 浙江师范大学硕士论文 Abstract the linear of residues，is anhydrousglucose Cellulose，apolymerp一1，4一linked the ofefficient mostabundant onthe to techniques earth．Owingshortage biopolymer of forcellulose successhavebeenachievedontheutilization degradation，limited is a cellulose．In possess nature，cellulosedegradedmainlybymicroorganisms，which seriesof enzymesincluding ce