RNA干扰技其应用.pptVIP

RNA干扰技术及其应用 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 RNAi（RNA interference，RNA干扰） Double-stranded RNA inhibits expression of genes homologous to that RNA. 双链RNA抑制含其同源序列基因的表达 Brief History of RNAi Discoveries 1990年，RichJorgensen 设想，在矮牵牛中花插入一种催生红色素的基因，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，花的颜色变为白色，当时称共抑制（cosuppression) 三.RNAi作用机制 起始阶段 病毒基因、人工转入基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA 这些dsRNA被胞质中的RNaseⅢ特异核酸酶Dicer切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA siRNA的特点：3’端均有2～3个突出的核苷酸 siRNA双链结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex, or RISC） siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA。 依次循环： 新合成的长链dsRNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成一切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。 获得siRNA产物 1、化学合成 尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。 由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”?就可以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA?，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。 在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III比用Dicer要便宜）。 不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗 4.siRNA表达载体 毫无疑问，siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。 4.siRNA表达载体 5. siRNA表达框架 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。 和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。 因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配！ 如果在PCR两端添加酶切位点